[求救] qPCR DDW有值

看板Biotech作者 (沒有錢)時間1年前 (2022/08/11 10:28), 1年前編輯推噓4(4推 0噓 16→)
留言20則, 6人參與, 1年前最新討論串1/1
如題，雖然網路上很容易就能找到一堆文章 但照做以後都沒改善，找原因找到快發瘋QQ 因為身處老闆比我更不認識生科技術的環境，小妹又才疏學淺 希望板上大神不吝指教orz qPCR目標基因分別是動物性基因12S跟植物性基因5.8S 使用Qiagen QuantiNova Porbe PCR kit跑40cycles 跟protocol不一樣的是 原廠是建議primer.probe最終濃度0.4μM及0.2μM(duplex分別的濃度) 而實驗室目前使用最終濃度為0.7μM及0.2μM(singleplex) 猜測是前人立方法的時候覺得我們只跑一個基因，下濃一點也沒關係（？） 但這不知道會不會影響？ 水的出值從Ct36-39不等，偶爾也會未檢出 目前做過的改善： pipette拆卸清理，用DNase擦過 primer.probe重配、水重新滅菌 qPCR儀器光學校正 也有想過人員污染，畢竟人就是動物 但現在的情況是植物性基因光P水也會有值……… 實在是不曉得哪裡還會污染到QQ 希望能夠指點迷津 ----- Sent from JPTT on my Sony J9110. -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 42.72.68.233 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1660184913.A.C3A.html
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08/11 12:18, 1年前 , 1F
如果植物性的基因也有Ct，那就未必是污染
08/11 12:18, 1F
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08/11 12:20, 1年前 , 2F
我個人會嘗試降低 primer&probe 的濃度，尤其是當有加
08/11 12:20, 2F
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08/11 12:22, 1年前 , 3F
入template的時候Ct都很低的狀況(<25，<20尤佳)
08/11 12:22, 3F
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08/11 12:23, 1年前 , 4F
做實驗有一個觀念，所有的反應都與濃度和溫度有關，就
08/11 12:23, 4F
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08/11 12:24, 1年前 , 5F
算是理想上不會發生的反應，只要反應物濃度夠高也會發
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08/11 12:24, 1年前 , 6F
生
08/11 12:24, 6F
感謝回覆！ 有加入template的正反應Ct都落在16-18左右 會再跟老闆討論看看，是否可以往這個方向走 現在就是被覺得學理上就算primer.probe濃度比較高也不會影響反應 畢竟沒有的東西就是該沒有 雖然也知道這邏輯，但畢竟濃度高了兩倍感覺變因還是很多 囧
推
08/11 15:19, 1年前 , 7F
Ct36-39就當NTC cut off不就好
08/11 15:19, 7F
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08/11 15:20, 1年前 , 8F
如果你有加template的樣本從來沒有超過 25 的 Ct ，那
08/11 15:20, 8F
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08/11 15:21, 1年前 , 9F
把 >35 的通通當 negative 就好，只是萬一有出現 Ct 在
08/11 15:21, 9F
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08/11 15:21, 1年前 , 10F
30 上下的樣本就不好判讀了
08/11 15:21, 10F
其實我們目前就是把Ct35當判定界線沒錯 但就是被老闆問為什麼水會有值…… 囧 自己以前的學術經驗沒人會在意Ct值這麼後面的東西 但老闆就覺得這樣不是辦法（？）於是上來討教QQ
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08/11 15:22, 1年前 , 11F
通常DDW有的話 就是probe品質撐不過你的cycle數 水解了
08/11 15:22, 11F
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08/11 15:22, 1年前 , 12F
你probe下濃的話 水解掉的量就高 所以CT 36就有. 你還不
08/11 15:22, 12F
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08/11 15:22, 1年前 , 13F
如拿跑完的產物跑電泳 看有沒Band
08/11 15:22, 13F
實驗室沒有電泳設備（跪） 不然已經想跑膠肖想很久了…… 水解的問題我沒想過會影響到，感謝思路！ ※ 編輯: Netline (118.160.140.220 臺灣), 08/11/2022 23:35:04
推
08/14 08:40, 1年前 , 14F
自從知道有 eDNA的檢測和應用之後，我就放開疑惑了。
08/14 08:40, 14F
環境DNA四處都有就let it go的意思嗎？XDDD
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08/15 20:21, 1年前 , 15F
沒確定沒污染的話就降低primer濃度，縮短annealing時
08/15 20:21, 15F
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08/15 20:21, 1年前 , 16F
間。根本方法是調整序列
08/15 20:21, 16F
會再來試看看的！
推
08/17 05:18, 1年前 , 17F
DDW Ct36-39的曲線長怎樣? 如果不是sigmoid曲線(e.g.
08/17 05:18, 17F
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08/17 05:20, 1年前 , 18F
positive control那種) 而是訊號慢慢增加上飄 應該就是
08/17 05:20, 18F
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08/17 05:21, 1年前 , 19F
雜訊了 最可能的是probe水解掉了
08/17 05:21, 19F
是那種明顯指數增長的曲線 之前也遇過如您敘述的訊號上飄，重配後就有解決
推
08/24 14:50, 1年前 , 20F
建議可以找 QIAGEN 專員討論
08/24 14:50, 20F
更新一下，也謝謝幾位先進的解答 目前做起來比較穩定了，貌似primer真的太濃啦～～ ※ 編輯: Netline (223.138.117.94 臺灣), 09/02/2022 13:46:32
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