[求救] Western band 糊掉、斷裂+背景髒

看板Biotech作者 (.)時間3年前 (2021/05/15 17:42), 2年前編輯推噓12(12推 0噓 34→)
留言46則, 13人參與, 2年前最新討論串1/1
前輩們好!! 想請教關於western blot的問題， 先提供我的實驗條件: 1. sample protein 100 ug , loading 15 uL 2.running 60V/25min + 110V/120 min (埋冰上) 3.transfer 10V/110min (半乾式) 2+3的條件都是沿用學長的 PVDF膜浸泡甲醇從5分鐘改到10分鐘甚至超過都有 Blocking 3% BSA 2 hr/RT, 一抗 4℃/overnight (也有shaker) →Wash 4*10min (原本3次改4次) →二抗 1hr/RT →Wash 4*10min ECL也是1:1配法 製膠配方: 10%膠 下膠: 30% acrylamide 4 mL + H2O 4.8 mL+ 1.5M Tris HCl 3 mL+ 10% SDS 120 uL+ TEMED 16 uL+ 10% APS 100 uL 上膠: 30% acrylamide 0.83 mL + H2O 3.67 mL+ 0.5M Tris HCl 0.42mL+ 10% SDS 50 uL+ TEMED 10 uL+ 10% APS 25 uL Ponceau S 跟coomassie blue 都染過很正常看不出特別問題 問題為: 1. β-actin或是其他band 總是會有糊掉的情形，原本沒有但是突然出現，之後就再也回不去了，β-actin最嚴重!! β-actin一抗濃度為1:5000、二抗為1:7500 其他測的有COX-2 (一抗, TRPV1, TRPA1 2.background有時會有直線痕跡以及偶爾出現很髒的背景 這個直線痕跡時好時壞，有時候還會有很像水痕狀的感覺 調整: 有試過當日現配running buffer但沒有顯著影響 也有試過當天製膠當天跑(原本都是前一天下午製膠) 但也沒有影響 因為實在調整過很多條件但都沒有改善QQ 希望前輩們能給予意見 謝謝!!! 以下附圖: Ponceau S https://m.imgur.com/a/7AdMBuW coomassie blue https://imgur.com/a/vTzvyhm 糊掉的band: https://imgur.com/a/v1O2bSj https://imgur.com/a/DzrncRy 背景髒、直線痕跡: https://imgur.com/a/b2nxg36 https://imgur.com/a/Juehq1V -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 219.68.108.51 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1621071755.A.F0B.html
推
05/15 18:34, 3年前 , 1F
會不會是sample的問題，沒有破乾淨或有一些殘渣之類
05/15 18:34, 1F
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05/15 18:34, 3年前 , 2F
看你marker跑得很漂亮應該不會是western步驟的關係
05/15 18:34, 2F
Sample均質過後離心有放-80隔夜然後又重新高速離心，所以我覺得離的算蠻乾淨的 (20000 rcf/ 10min)，不好意思，忘記說我的sample是大鼠腸組織QQ
推
05/15 18:43, 3年前 , 3F
blocking 是用奶粉泡的嗎 有沒有確認都溶解了再加下去
05/15 18:43, 3F
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05/15 18:43, 3年前 , 4F
blocking?
05/15 18:43, 4F
Blocking 是用3% BSA，也有用小飛碟過濾
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05/15 22:26, 3年前 , 5F
Transfer buffer 最好每次新配
05/15 22:26, 5F
因為半乾式所使用的transfer 量不多所以每次重新配好像有點難度QQ
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05/15 22:40, 3年前 , 6F
Sample可能有太多DNA 建議先做完sonication再loading
05/15 22:40, 6F
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05/15 22:40, 3年前 , 7F
而且sample的量100ug/well太多了 最多不超過40ug/well
05/15 22:40, 7F
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05/15 22:51, 3年前 , 8F
05/15 22:51, 8F
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05/15 22:51, 3年前 , 9F
ce/protein-biology/protein-biology-learning-center
05/15 22:51, 9F
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05/15 22:51, 3年前 , 10F
/protein-gel-electrophoresis-information/western-b
05/15 22:51, 10F
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05/15 22:51, 3年前 , 11F
lot-troubleshooting.html#pge1提供你參考
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05/15 22:52, 3年前 , 12F
重新弄個縮網址https://reurl.cc/WElgOx
05/15 22:52, 12F
不好意思，請問sonication是?? Sample protein原本有試過50 ug 跟100 ug 比較，但因 為100 ug壓出來的band會比較清楚明顯所以才選用100ug，https://imgur.com/QxYnofi
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05/16 00:18, 3年前 , 13F
100ug 太多
05/16 00:18, 13F
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05/16 14:33, 3年前 , 14F
wash buffer的ph值有沒有調?
05/16 14:33, 14F
Wash buffer 都是用配好的10被稀釋，所以沒有特別去調PH
推
05/16 21:06, 3年前 , 15F
我寧願改變抗體濃度，
05/16 21:06, 15F
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05/16 21:06, 3年前 , 16F
也不要sample多到影響背景。
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05/16 21:06, 3年前 , 17F
蛋白要是很好抓，少量就夠了。
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05/16 21:06, 3年前 , 18F
大不了曝光時間拉長。
05/16 21:06, 18F
好的，會再進行調整看看，謝謝!!
推
05/16 21:45, 3年前 , 19F
100有點太多， 跑的時候很容易漏+變形。這種小膠40ug
05/16 21:45, 19F
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05/16 21:45, 3年前 , 20F
就很多了； 建議同上可以拉高一抗的強度然後曝光久一
05/16 21:45, 20F
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05/16 21:45, 3年前 , 21F
點
05/16 21:45, 21F
好的，會再減半蛋白量試試，謝謝!!
推
05/16 21:47, 3年前 , 22F
WB圖看起來像transfer 時膜跟膠之間沒貼好，有buffer殘留在
05/16 21:47, 22F
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05/16 21:47, 3年前 , 23F
中間。
05/16 21:47, 23F
有可能是膠放上去沒有壓好@@，覺得半乾式就是會有一種不確定到底東西有沒有壓好的窘 境@@
推
05/16 21:52, 3年前 , 24F
b-actin 看起來有點像過曝後稍微反白的情況? 我壓過鼠
05/16 21:52, 24F
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05/16 21:52, 3年前 , 25F
小腸 那時候下50ug 我 actin一抗是下1:10k 起跳的..
05/16 21:52, 25F
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05/16 21:52, 3年前 , 26F
. 有時候一或二抗 濃度太多都會有疑似的擦去痕跡
05/16 21:52, 26F
推
05/16 21:56, 3年前 , 27F
blocking有試過奶粉嗎? 最下面那張 比較美的膠圖還是
05/16 21:56, 27F
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05/16 21:56, 3年前 , 28F
許多非專一結合，搞不好用牛奶後就不用這麼多 lysate
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05/16 21:56, 3年前 , 29F
了?
05/16 21:56, 29F
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05/16 21:58, 3年前 , 30F
我通常是濕式轉，有朋友半乾轉的可能因為蓋子壓不緊而
05/16 21:58, 30F
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05/16 21:58, 3年前 , 31F
轉不好
05/16 21:58, 31F
我的actin 一抗1:5000去壓，是沿用學長姐之前配好的比例，二抗是1:7500 也是沿用學 長姊QQ ，blocking有試過奶粉但效果沒有太大差異T_T，有注意到蓋子有可能沒壓緊，所 以現在下手會重一點!! 謝謝!!
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05/17 21:16, 3年前 , 32F
Domination 將sample利用超音波震盪把DNA震碎避免黏稠
05/17 21:16, 32F
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05/17 21:16, 3年前 , 33F
Sonication
05/17 21:16, 33F
了解!! 因為我們家實驗室好像沒有這個習慣，通常均質完離心就開始配，之後會嘗試看 看謝謝!!
推
05/17 22:59, 3年前 , 34F
我之前是用 syringe 過 sample 幾次讓它不黏稠，沒有 soni
05/17 22:59, 34F
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05/17 22:59, 3年前 , 35F
cator 的話可以試試。
05/17 22:59, 35F
好的，謝謝!! 會再試試
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05/18 06:44, 3年前 , 36F
我試過用26G針過好幾次，雖然會變的不黏稠，但是跑WB還
05/18 06:44, 36F
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05/18 06:45, 3年前 , 37F
適有嚴重拖條現像，DNA的問題要根治我覺得只有把DNA沉
05/18 06:45, 37F
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05/18 06:46, 3年前 , 38F
澱離心掉，或者用DNase I或Benzonase把DNA切掉這兩種
05/18 06:46, 38F
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05/18 06:46, 3年前 , 39F
方法最有效
05/18 06:46, 39F
好的，因為實驗室好像沒有這方面處理經驗，我會再詢問看看，謝謝!!
推
05/19 00:04, 2年前 , 40F
換另一個牌子的抗體看看！
05/19 00:04, 40F
ㄜ….經費考量QQ
推
05/19 02:37, 2年前 , 41F
想問你 pipet樣品時有勾勾 (台語) 的嗎？ 如果沒有DNA
05/19 02:37, 41F
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05/19 02:37, 2年前 , 42F
問題可能不用太擔心
05/19 02:37, 42F
不會耶! 挺順的(?
推
05/20 00:43, 2年前 , 43F
以前半乾式transfer是教定電流 90mA/片 的樣子？
05/20 00:43, 43F
學長姐教訂電壓10V =口= ※ 編輯: Gmarket (219.68.108.51 臺灣), 05/21/2021 18:35:29
推
05/22 01:09, 2年前 , 44F
你的sample buffer? 買個現成的蛋白來做梯度練習，
05/22 01:09, 44F
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05/22 01:09, 2年前 , 45F
我覺得你的膠到壓好半乾可能都不太穩定。最好找abcam
05/22 01:09, 45F
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05/22 01:09, 2年前 , 46F
的protocol 全部照著重做一次，到你的梯度穩定為止。
05/22 01:09, 46F
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