[求救] MRC-5 trypsinize後存活不佳

看板Biotech作者 (Shiburin)時間3年前 (2020/11/09 22:02), 3年前編輯推噓3(3推 0噓 12→)
留言15則, 4人參與, 4年前最新討論串1/1
大家好 不好意思又來打擾 最近開始養MRC-5這株Lung fibroblast Medium的成分都是完全參照ATCC 養起來型態都挺正常的 (就是癌細胞養慣了覺得長的好慢) 只是在Trypsinized後染Trypan blue 都會有很多死細胞跟碎屑(碎屑是被切掉的fibrin?) 想請問可能的原因和改進方法 雖然種回去還是會慢慢長起來 但本來一盤能收到的細胞數就很少了 還死很多 長的又慢 好難做實驗QQ 以下附上培養跟操作的condition和protocol! 培養盤:10cm falcon dish 0.05% Trypsin-EDTA 0.08% Trypan blue in PBS PBS 大概養到8-9成滿就會繼代 2ml PBS wash 2次後加入2ml 0.05% Trypsin-EDTA 來回Rinse約10秒後吸除Trypsin 室溫作用大約3分鐘 在顯微鏡下觀察細胞變亮，貼盤的纖維都切除為止 用Medium中和並冲下細胞後以1250rpm,5分鐘離心 去除上清液，加入1ml medium輕pipette約15次打散細胞進行計數 有試過用0.025% Trypsin以及 更溫和的Dissociation reagent(Accutase) 但都沒有好轉的現象 想請問有培養過這株細胞的前輩們分享你們培養時的條件 萬分感謝！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 120.126.50.146 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1604930527.A.F82.html
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11/09 23:15, 3年前 , 1F
為何要先吸去Trypsin?這樣整盤幹幹的細胞本來就容
11/09 23:15, 1F
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11/09 23:15, 3年前 , 2F
易死
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倒是沒有想到會乾掉的問題 謝謝提醒! 後來用Accutase的時候有把1.5ml留在dish內
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11/09 23:18, 3年前 , 3F
加trypsin反應，拍一拍細胞有浮起來加入medium/PBS
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11/09 23:18, 3年前 , 4F
pipetting將cell sol.移到離心管即可，不用先將tr
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11/09 23:18, 3年前 , 5F
ypsin吸去
11/09 23:18, 5F
我會試試看 因為我看ATCC對每個細胞的Trypsin時間都說5-15分鐘... 說不定3分鐘的Trypsin都還嫌太久了!
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11/09 23:27, 3年前 , 6F
建議你再看一下ATCC的subculture的步驟https://www
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11/09 23:27, 3年前 , 7F
.atcc.org/products/all/CCL-171.aspx
11/09 23:27, 7F
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11/09 23:28, 3年前 , 8F
11/09 23:28, 8F
※ 編輯: steve42125 (120.126.50.146 臺灣), 11/10/2020 11:00:31 ※ 編輯: steve42125 (120.126.50.146 臺灣), 11/10/2020 11:02:44
推
11/11 18:44, 3年前 , 9F
trypsin應該都加下去放37度幾分鐘吧 吸掉後又放37度
11/11 18:44, 9F
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11/11 18:44, 3年前 , 10F
超快乾的
11/11 18:44, 10F
推
12/27 11:50, 3年前 , 11F
通常都是trypsin 37度5分鐘
12/27 11:50, 11F
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12/27 11:51, 3年前 , 12F
拍一拍有下來用至少3倍medium中和
12/27 11:51, 12F
推
01/03 10:25, 4年前 , 13F
細胞來自ATCC或BCRC？我們也有遇到類似問題，但BCRC的細
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01/03 10:25, 4年前 , 14F
胞脆弱很多，ATCC至少比較耐Trypsin，不過後來都改成Accu
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01/03 10:25, 4年前 , 15F
tase了
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