[求救] Western 條帶反白
代PO
一開始使用1:500濃度的的一抗，曝光時間一分鐘，出來是有東西的
https://i.imgur.com/pOJQykG.png
後來新的一批細胞收下來之後(實驗條件全部相同)，曝光時間才2秒就變這樣QQ，目標蛋
白直接變成白色的，其他分子量的蛋白也是全部反白了
https://i.imgur.com/04djSL0.png
之後在想是不是抗體濃度太高，調整到1:2000，結果還是一樣全部反白
https://i.imgur.com/qdF2hv7.png
實驗條件
蛋白濃度:20mg/ml
垂直式電泳電壓70~120V跑到看到蛋白在底部
Transfer(全濕式)用400mA轉90分鐘，有確定看到prestained marker在膜上
Blocking(5%脫脂奶粉)30分鐘
一抗:用過1:500,1:1000,現在是用1:2000 冰箱搖overnight
PBST wash30分鐘，每10分鐘換一次
二抗:1:1000室溫搖1hr
PBST wash 30分鐘，每10分鐘換一次
用機器壓片，沾ECL，曝光時間從最短1/8秒一路增加到最多2分鐘
想請問各位大大有遇過一直反白的情形嗎，壓不出正常黑色的BAND了
請問這種情況該怎麼解決呢 ?
--
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