各位前輩好
最近做co-ip跑銀染時band都不是很理想
想麻煩前輩們幫忙看看是不是哪裡出問題> <
感激不盡！！
簡述co-ip做法：
先用protein A的beads binding antibody
再加入protein lysate mix overnight
隔天再用sample buffer 煮100度10分鐘elution
跑膠load sample時會連磁珠一起下去跑
曾經有使用過total protein lysate去做coip並染coomassie blue（步驟與前述都相同）
有band但感覺雜band超級多
https://i.imgur.com/lRODvjd.jpg
後來改抽membrane protein去做coip
用的是Thermo的MEM-PER plus kit
下800mg的protein去做binding
第一次做沒有測elute出來的蛋白濃度
下20ul含beads去染銀染
銀染用Thermo的silver stain for mass spec kit做
band的深淺看起來超不穩定
右方兩組是IgG
其他都是實驗組
https://i.imgur.com/8WPv78E.jpg
第二次做有測濃度
最後elute出來的蛋白濃度約0.3mg/ul
下40ul含beads去染銀染
右方兩組是input
中間兩組是IgG
左方兩組是我的實驗組
https://i.imgur.com/GhR5puJ.jpg
第二次下的量明明比較多
但看到的band卻比較少
看最上方好像是都卡住沒有跑下來 ( ?
猜測可能的問題有
1.膠體配錯
2.磁珠太多
3.elution用的sample buffer elute不下來
但先前染coomassie blue步驟一樣好像也沒這個問題
麻煩各位救救我了
謝謝！！！！！！！！
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.122.220 (臺灣)
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1579098346.A.6DF.html
※ 編輯: evayoyo (140.112.122.220 臺灣), 01/15/2020 22:27:26
※ 編輯: evayoyo (140.112.122.220 臺灣), 01/15/2020 22:28:05
※ 編輯: evayoyo (140.112.122.220 臺灣), 01/15/2020 22:29:46
※ 編輯: evayoyo (140.112.122.220 臺灣), 01/15/2020 22:31:54
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想請教跑出來的band這麼奇怪會是因為上方卡了很多像蛋白的東西沒有完整跑下來嗎？有的
我有wash，但是是用PBS wash，當初是另一個實驗室的學姐建議的，她有這樣做過說沒有問
題。請問要怎麼確定飽和呢？抱歉我是新手問題很多QQ 我coip抓下來的東西有去壓western
也有看到我目標蛋白的band，但在銀染的圖中該位置卻沒有看到band，謝謝你的建議！但是
現在銀染都沒有band QQ
※ 編輯: evayoyo (101.15.140.197 臺灣), 01/16/2020 02:34:41
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