[求救] ligation 片段不對

看板Biotech作者 (米克)時間4年前 (2019/10/30 01:53), 編輯推噓8(8推 0噓 36→)
留言44則, 11人參與, 5年前最新討論串1/1
我們實驗室用TOPO TA cloning kit包括勝任細胞也用買的. Vector 用PCR2.1vector ，長度大約3.5k Insert 為PCR產物切膠純化，大約1719bp，純化後的產物再跑膠確認一次。另外有經過sequencing確認頭尾兩端在正確的位置，不過定序結果訊號很弱也沒重做。 按照protocol做ligation和heat shock transform後塗盤，挑6顆白色菌落抽plasmid。之後用cloning primer 做PCR檢察，結果4顆空包彈，另外兩顆有band,不過長度只有400bp。 之後將cloning primer 拆開來分別和我診斷用的primer搭配再跑pcr檢察看看 1. Cloning primer forward+diagnostic primer reverse 產物預計450bp 2. Diagnostic primer forward+cloning primer reverse 產物預計350bp 結果只有1有產物 想知道有哪些原因造成這樣的結果，還是再多挑幾個菌落看看就中獎了？ ----- Sent from JPTT on my iPhone -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 223.136.161.55 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1572371599.A.0A8.html
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10/30 13:44, 4年前 , 1F
把vector 用酵素切1刀後對大小，多切幾刀也可以
10/30 13:44, 1F
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10/30 13:45, 4年前 , 2F
感覺像是菌體遇到特定片段修飾了植體
10/30 13:45, 2F
推
10/30 17:30, 4年前 , 3F
cloning基本上花時間trouble shooting不如多做幾次吧
10/30 17:30, 3F
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10/30 19:15, 4年前 , 4F
1. 你的 Insert 多大？ 2. 空包彈是指玩全沒有PCR產
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10/30 19:16, 4年前 , 5F
物嗎？
10/30 19:16, 5F
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10/30 19:18, 4年前 , 6F
Cloning primer 是你用來放大 insert 的 primer 還是指
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10/30 19:19, 4年前 , 7F
pCR2.1 上面用來 screening 的 primer？
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10/30 21:38, 4年前 , 8F
我個人是colony pcr都跑24顆的倍數啦 給你參考
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10/31 12:20, 4年前 , 9F
PCR產物可以試試clean up後直接ligate，不要跑膠純化
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10/31 19:42, 4年前 , 10F
PCR完不跑膠就做clean up,怎麼知道有產物？
10/31 19:42, 10F
推
10/31 19:43, 4年前 , 11F
insert用什麼DNA polymerase去P的？
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10/31 19:43, 4年前 , 12F
如果跑完膠再做clean up,何不直接把那塊膠切下來純化
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推
10/31 19:55, 4年前 , 13F
我想樓上只是想增加產量，跑膠取個一滴滴就好，其他拿去cl
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10/31 19:55, 4年前 , 14F
ean up，回收產量比切膠來的多
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10/31 20:00, 4年前 , 15F
clean up好一點有95%,跑膠回收量應該也有80~90%,我是不相
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10/31 20:00, 4年前 , 16F
信兩種會差多少啦,何況clean up還要浪費那一滴滴
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推
10/31 20:09, 4年前 , 17F
或許我們用的kit不好吧，我兩種回收率差不少XD
10/31 20:09, 17F
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10/31 20:13, 4年前 , 18F
其實seamless cloning已經很成熟了，但還是看到大家普遍在
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10/31 20:13, 4年前 , 19F
用這些傳統方法，實在覺得有點沒效率
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10/31 23:23, 4年前 , 20F
因為$$$啊.....
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10/31 23:24, 4年前 , 21F
我實驗室用的 PCR clean up/Gel extraction Kit 會有差
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10/31 23:24, 4年前 , 22F
，但是可以差很多也可以差很少，然後我覺得 column 放
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10/31 23:25, 4年前 , 23F
久了回收率都會變差，可能有氧化變質的問題吧...
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10/31 23:55, 4年前 , 24F
$其實不是啥問題，反而比傳統法省時省錢，以Gibson overla
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10/31 23:55, 4年前 , 25F
p方式設計primer去p insert，cotransform insert & vector
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10/31 23:55, 4年前 , 26F
，剩下的事，E.coli都會幫你完成
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11/01 00:13, 4年前 , 27F
序列拿出來要仰賴PCR,每次都要送定序檢查,不愛用
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推
11/01 00:21, 4年前 , 28F
gel extraction通常不會到八九成吧 大多三四成
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11/01 00:39, 4年前 , 29F
那是因為許多人為了用濃的insert做ligation,elute體積少到
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11/01 00:39, 4年前 , 30F
誇張,Qiagen Gel Extraction manual就有這樣的data
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11/01 00:43, 4年前 , 31F
就連台廠genemark,geneaid這些也都有80%的水準了
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11/01 00:51, 4年前 , 32F
overlap放進MCS後，定序一次確認ok後，未來愛怎麼搬就怎
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11/01 00:51, 4年前 , 33F
麼搬，不用再定序呀，且一般發問都是接不進去的，放不進去
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11/01 00:51, 4年前 , 34F
後面也不用談定序了
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11/01 00:52, 4年前 , 35F
自己是蠻愛用的啦XDD
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11/01 08:48, 4年前 , 36F
其實也不全是產量多的關係，有時候就是跑膠純化接不起來
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11/01 08:48, 4年前 , 37F
，pcr clean up就可以，推測是跑膠後a tail不見了@@
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11/01 08:50, 4年前 , 38F
而且TA說真的不需要跑膠純化，多浪費時間而已
11/01 08:50, 38F
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11/01 21:05, 4年前 , 39F
有很多好用的 kit ，如果$$不是問題的話
11/01 21:05, 39F
推
11/02 10:58, 4年前 , 40F
除非很確定 PCR產物很純，不然直接 clean up拿去接會很慘。
11/02 10:58, 40F
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11/02 10:58, 4年前 , 41F
建議還是要切膠。
11/02 10:58, 41F
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01/16 21:22, 5年前 , 42F
這個我做過，切膠回收會比較好，但還是有小片段(跑PCR
01/16 21:22, 42F
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01/16 21:22, 5年前 , 43F
是看不到的)；ligation的時候小片段就是比較容易接上，
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01/16 21:22, 5年前 , 44F
用力用colony pcr挑吧
01/16 21:22, 44F
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