[求救] acetone/methanol沉澱蛋白回溶

看板Biotech作者 (飛羽)時間5年前 (2019/04/26 23:30), 編輯推噓5(5推 0噓 17→)
留言22則, 5人參與, 5年前最新討論串1/1
小弟我進行植物的蛋白以TCA/Acetone方法沉澱蛋白 以８Ｍ GnHCl+Hepes 含有DTT等回溶一晚 進行化學修飾之後再進行一次8x Acetone/1x methanol沉澱 3小時 -80度 以methanol洗兩次之後 過程中離心14000g 20 min 第一次風乾pellet 1小時 pellet半透明 有點黃 我依照文獻用極小量的50mM NaOH再加入HEPES buffer 一直vortex 很難溶 留有很多塊狀pellet 因為很多文獻都說不可以太乾 但是沒有說怎麼樣叫太乾 會很難溶 第二次 我依照不同乾燥時間去回溶 在第20min時pellet縮小 有點黃 第30min時 pellet有點片狀 有點透明 第35min時 pellet有點硬 第40分鐘時 pellet明顯很硬 在35分鐘以前的狀態 我加入NaOH後都可以很快地把pellet變成乾燥前那種白色疏鬆的狀態 加入buffer後也可以變成沒有塊狀體的混合液 但是無法真的溶解 離心後還是白色粉狀沉澱 上清液定量後的濃度很低 想請問大大們 應該要乾到什麼程度 回溶時應該怎麼操作 須不須要加熱 37度 50度 之類 vortex 或是將上清移除 加新的buffer如此重複 畢竟蛋白也有溶解度 或是一定要放過夜的時間長度 因為時間的關係非常希望不要隔夜 不然一周做不完 接下來的過程要處理trypsin等等 無法使用Urea和DTT來幫助溶解 希望有高手可以指教 不知道大家的回收率是多少? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 118.171.111.18 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1556292659.A.9E7.html
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04/26 23:33, 5年前 , 1F
文中的第一次和第二次都是指後面的acetone/methanol操作
04/26 23:33, 1F
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04/27 00:21, 5年前 , 2F
sonication?
04/27 00:21, 2F
推
04/27 01:51, 5年前 , 3F
1% SDS + beta-mercap 95度作用應該可溶
04/27 01:51, 3F
推
04/27 02:59, 5年前 , 4F
之前TCA沉澱是 acetone洗完放hood 10分鐘就加 sample
04/27 02:59, 4F
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04/27 02:59, 5年前 , 5F
bfr煮10分鐘，會溶完; 但我的 pellet都米粒大小而已
04/27 02:59, 5F
推
04/27 03:50, 5年前 , 6F
除非上2D不然我都寧願dialysis+amicon XD
04/27 03:50, 6F
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04/27 03:51, 5年前 , 7F
sds應該比較強, 1%不夠就2%, 但是你的protein就肯定
04/27 03:51, 7F
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04/27 03:51, 5年前 , 8F
死光
04/27 03:51, 8F
推
04/27 09:30, 5年前 , 9F
你是要做 in solution digestion嗎
04/27 09:30, 9F
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04/27 09:30, 5年前 , 10F
如果是不用再沈澱 直接稀釋到1M以下GnHCl就可以繼續了
04/27 09:30, 10F
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04/27 09:30, 5年前 , 11F
高鹽狀況下直接用有機溶劑沈澱通常鹽也會一起析出建
04/27 09:30, 11F
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04/27 09:30, 5年前 , 12F
議真的沒辦法就先desalt 在往後做沈澱
04/27 09:30, 12F
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04/29 11:18, 5年前 , 13F
因為digestion後還要做一次化學真對NH2的修飾 這步驟要
04/29 11:18, 13F
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04/29 11:18, 5年前 , 14F
去掉前一次修飾的填加物 就算dilute直接trypsin 勢必要
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04/29 11:18, 5年前 , 15F
再沉澱一次
04/29 11:18, 15F
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04/29 11:20, 5年前 , 16F
如果先dilute降低GnHCl再沉澱會否讓鹽不會一同沉澱 就比
04/29 11:20, 16F
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04/29 11:20, 5年前 , 17F
較好溶 但是methanol不是應該把鹽都洗掉嗎?
04/29 11:20, 17F
推
04/29 22:35, 5年前 , 18F
這樣的話digestion 完用C18 desalt或是第一個修飾找看
04/29 22:35, 18F
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04/29 22:35, 5年前 , 19F
看有沒有chemical 可以quenching (IAA可以用DTT)metha
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04/29 22:35, 5年前 , 20F
nols 造成的鹽析出會跟蛋白喇在一起 然後整塊硬掉 稀
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04/29 22:35, 5年前 , 21F
釋是一個解可是稀釋後沈澱回收變比較低可以的話用其他
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04/29 22:35, 5年前 , 22F
desalt 放是比較好
04/29 22:35, 22F
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