[求救] 如何提升RNA提取質量

看板Biotech作者 (Right of Left)時間5年前 (2019/04/22 21:55), 5年前編輯推噓10(10推 0噓 23→)
留言33則, 8人參與, 5年前最新討論串1/1
大家好，目前提取RNA遇到一個瓶頸，想請版友指點迷津： 收集RNA的步驟是使用Trizol and Chloroform 去提取，我的樣品條件會同時重複8組，每 一組樣品下25萬顆細胞，之前都能順利收到足夠質量的RNA進行後續轉cDNA步驟，但最近 出現相同手法但是總質量都過低情況。 每次收集下來的RNA我都固定溶於10ul DEPC water，所有樣品固定使用1ml Trizol進行提 取。 第一次失敗樣品總共重複8組，我想說過程可能不小心出錯，第二次保險起見，我樣品準 備了10組（提高細胞數量），並以相同提取方法再試一次，分析濃度後如下圖： https://i.imgur.com/RGlqkx2.jpg
第三次我一樣準備10組樣品，此次改變一些手法，樣品使用冰的PBS進行清洗後（看能否 避免降解）再加入Trizol，加入Trizol後再使用刮棒進行刮除，接著把Trizol吸取到15ml 離心管，放置到冰浴上(希望能避免降解），接著再清洗第二組樣品，然後把離心管內的T rizol再抽出來加入第二組樣品，重複步驟持續下去... 分析的濃度如下圖： https://i.imgur.com/ki1w6uC.jpg
由於RNA轉成cDNA需要5ug，已連續3次出現整體RNA質量不足的情況，目前想不出哪些可能 原因造成此情況，想請版友不吝指教或者分享相關經驗。 謝謝 感激不盡 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 58.114.139.73 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1555941315.A.9F6.html
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04/22 22:32, 5年前 , 1F
純度很高，傳統法的產率不太受降解影響。 提高細胞量增加
04/22 22:32, 1F
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04/22 22:32, 5年前 , 2F
到10Λ6應該就ok了
04/22 22:32, 2F
但是之前的組別只需要8組樣品就能收到，此次數量多2組又質量不足，實在想不透 ※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/22/2019 22:58:26
推
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Trizol效期? 環境Rnase清潔?
04/22 23:54 謝謝Q大，效期的部分明日會確認看看，東西移出操作台後，使用的器具跟桌面都有使用7 5% E tOH/DEPC擦拭
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04/22 23:56, 5年前 , 4F
細胞定量法是否真的準確？ 細胞類型跟之前是否一樣？ 產
04/22 23:56, 4F
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04/22 23:56, 5年前 , 5F
量降到之前的多少%？ 試劑(包含DEPC水)是否都是相同的sto
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04/22 23:56, 5年前 , 6F
ck? 定量用的cuvette是否相同？ 是否能找到Nanodrop測定？
04/22 23:56, 6F
謝謝J大，關於細胞數量部分，樣品處理前會使用光學顯微鏡觀察，細胞密度看起來跟以 前沒太大差異，先前8組樣品一起收下來的RNA約600-750ng/ul，總體積一樣回溶在10ul， 回溶後我都固定存放於-80冷凍2天再進行分析濃度，分析完後直接轉cDNA。 DEPC water、 Chloroform 、isopropanol都是室溫保存，但之前存放Trizol的冰箱故障 ，不知道是否有影響？ 分析濃度是以nanodrop，取出樣品1ul進行分析，分析前先以DEPC water當blank，所以之 前的濃度在分析完後剩下9ul，是足夠5ug進行後續cDNA步驟 分析的儀器如圖片，廠牌Microdigital https://i.imgur.com/FnZ9iBh.jpg
※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 00:11:41 ※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 00:12:32 ※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 00:20:09
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04/23 00:39, 5年前 , 7F
之前Trizol加入後是否還需要刮？ 一般細胞Trizol加入後就
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04/23 00:39, 5年前 , 8F
溶掉了
04/23 00:39, 8F
之前沒有刮耶，都是pipette沖一沖就好 ※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 01:07:15
推
04/23 09:03, 5年前 , 9F
我想問一下 ，轉 cdNa 需要 5ug 是實驗要求還是按照步
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04/23 09:03, 5年前 , 10F
驟？
04/23 09:03, 10F
推
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我之前100ng 都轉完上 RT 成
功惹 04/23 09:05 T大，我是按照實驗步驟，細胞實驗是到合作實驗室進行，轉cDNA的步驟是依照對方給的 。我好像看到一線希望@@ ※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 10:16:52 目前沒步驟，印象是oligo dt 1ul 、10mM dNTP 1ul、總共5ug RNA、剩下不足體積 以DEPC water補滿，總體檢13ul。 ※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 10:21:16
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04/23 10:42, 5年前 , 12F
之前沒有刮耶，都是pipette沖一沖就好 →→ lysis有問題，
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04/23 10:42, 5年前 , 13F
細胞未完全溶解，RNA抽不出來
04/23 10:42, 13F
J大，之前的方式是反覆吸取沖一沖，是可收到足夠量，直到出現第一次濃度過低後，我 第二次再重複一次也是如此，第三次使用刮棒重複刮個3-4次，刮棒都有去沾trizol再去 刮樣品表面 ※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 11:09:07
推
04/23 18:17, 5年前 , 14F
轉cDNA的kit是？5ug 的總量滿高的了，目前實驗室SSIII
04/23 18:17, 14F
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04/23 18:17, 5年前 , 15F
都只用 1ug 轉
04/23 18:17, 15F
首先第一步是加入下列試劑 1ul Oligo dT 1ul 10mM dNTP DEPC water(最後看差多少體積補足到13ul) 5ug的RNA 總體積:13ul 最後加入的試劑如下: 5x first strand reaction buffer: 4μl 0.1M DTT: 1μl RNase out: 1μl Super Script III (SS III): 1μl 總體積為20ul 再放進機器去跑 ※ 編輯: forever430 (140.116.159.183), 04/23/2019 18:51:50
推
04/23 21:25, 5年前 , 16F
你們RNA量加太多了,RNA超過1ug會出問題,導致最後RT出來
04/23 21:25, 16F
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04/23 21:25, 5年前 , 17F
的cDNA量參差不齊,1ug?1.5ug?2ug? sample的cDNA濃度不同
04/23 21:25, 17F
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04/23 21:26, 5年前 , 18F
cDNA是用來做其他實驗就算了,如果是用來做qPCR會有誤差
04/23 21:26, 18F
推
04/23 22:07, 5年前 , 19F
建議上網直接找 ssiii的步驟啦～ 口耳相傳的步驟很容
04/23 22:07, 19F
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04/23 22:07, 5年前 , 20F
易出問題 XDDD
04/23 22:07, 20F
忘了說明後續是做reverse PCR,感謝大家的意見 ※ 編輯: forever430 (223.138.55.87), 04/24/2019 00:50:53
推
04/25 22:13, 5年前 , 21F
RNA dry太乾了？
04/25 22:13, 21F
推
04/26 00:28, 5年前 , 22F
SSIII下5 ug不會太多啊, 而且問題根本不在這裡吧XD
04/26 00:28, 22F
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04/26 00:29, 5年前 , 23F
看起來不太像降解, 因為RNA碎片也是有濃度的喔XDD
04/26 00:29, 23F
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04/26 00:29, 5年前 , 24F
比較可能是操作上失手了, 例如C大說的dry的時候
04/26 00:29, 24F
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04/26 00:32, 5年前 , 25F
之前碰過容易殘留DNA的樣本~技術越熟練抽完濃度還越低..
04/26 00:32, 25F
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04/26 00:34, 5年前 , 26F
發現是因為殘留的DNA越來越少的緣故
04/26 00:34, 26F
推
04/26 07:22, 5年前 , 27F
如果同樣的步驟跟樣本，之前做很好，現在做不休，除了
04/26 07:22, 27F
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04/26 07:22, 5年前 , 28F
是否dry太乾之外（rna乾掉不溶於水），最好重新確定一
04/26 07:22, 28F
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04/26 07:22, 5年前 , 29F
次自己的試劑濃度沒有問題，之前碰過有人wash rna用
04/26 07:22, 29F
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04/26 07:22, 5年前 , 30F
的酒精濃度跑掉，洗之前看得到pellet，洗完pellet不
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04/26 07:22, 5年前 , 31F
見，定量的濃度永遠都很低。
04/26 07:22, 31F
推
04/29 00:12, 5年前 , 32F
建議買抽RNA的kit,自此之後細胞量可不用多,quality提
04/29 00:12, 32F
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04/29 00:12, 5年前 , 33F
高且穩定 (旭基的,記得每一sample不貴)
04/29 00:12, 33F
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