[求救] E. coli S17菌株subcloning問題請教

看板Biotech作者 (HYC)時間5年前 (2019/01/07 15:44), 5年前編輯推噓3(3推 0噓 21→)
留言24則, 6人參與, 5年前最新討論串1/1
版上前輩們好， 我是最近剛開始做cloning實驗的新手， 但因為cloning一直失敗， 盤不是長不出colony，不然就是直接長爆... 經由PCR check後也都沒有成功... （有換過新的digestion enzyme， 也有試過在不同溫度下ligase， 以及不同的ligase時間長短) 所以打算用實驗室之前已經存好的菌株下去做subcloning， 但因為學長沒有存到DH5a的菌株， 只有存到E. coli S17的菌株， 所以想來版上請教前輩們， 請問以S17這隻菌作為宿主的話， 我還能抽它的質體繼續做subcloning的實驗嗎？ 感謝指教！！！ ----- Sent from JPTT on my Sony F5121. -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 39.9.138.29 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1546847081.A.0BA.html ※ 編輯: Faustus73 (39.9.138.29), 01/07/2019 15:48:43
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01/07 16:15, 5年前 , 1F
是指學長留下的質體subclone都失敗才想從S17純化質體嗎
01/07 16:15, 1F
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01/07 16:17, 5年前 , 2F
那我會多花一點心思在確認學長的plasmid map正不正確
01/07 16:17, 2F
有噢，我是兩邊同步在進行的。原先的菌株抽完質體送定序後的結果，跟學長map中的cut site沒有產生突變，而且digestion後的跑膠結果，band的長度也和預期的差不多，但是怎麼接就是接不起來，盤總是不長colony...。剛好有找到這隻存在S17的基因序列有我實驗需要的片段，所以才考慮要從這隻菌下手，做subcloning。
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01/07 16:18, 5年前 , 3F
重新塗盤挑幾個菌落切切看酵素跟map有沒有一致
01/07 16:18, 3F
※ 編輯: Faustus73 (39.9.138.29), 01/07/2019 16:32:31
推
01/07 16:40, 5年前 , 4F
同上，序列跟抗性一定要對，做cloning最怕用前人的材料了
01/07 16:40, 4F
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01/07 16:45, 5年前 , 5F
insert有確認過的話，那vector呢？長爆的話可能是單一切點
01/07 16:45, 5F
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01/07 16:45, 5年前 , 6F
所以自接？
01/07 16:45, 6F
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01/08 09:26, 5年前 , 7F
如果有人帶著做troubleshooting會比較快知道原因
01/08 09:26, 7F
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01/08 09:27, 5年前 , 8F
沒人帶的話控制組跟紀錄本都要妥善，至少老師能幫你看
01/08 09:27, 8F
推
01/13 13:34, 5年前 , 9F
transformation後挑菌前, 用 Protoplasting assay 看到
01/13 13:34, 9F
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01/13 13:34, 5年前 , 10F
底是不是正常的 insert
01/13 13:34, 10F
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01/13 13:44, 5年前 , 11F
最好的情況是能挑20顆以上clones 作初篩
01/13 13:44, 11F
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01/13 14:44, 5年前 , 12F
別亂教叫人挑這麼多顆好嗎？這樣不叫troubleshooting
01/13 14:44, 12F
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01/13 17:09, 5年前 , 13F
會成功的 cloning，挑 1 顆，最多 3 顆就該挑到正確的
01/13 17:09, 13F
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01/13 17:09, 5年前 , 14F
clone 了，不會成功的 cloning，你挑 100 顆，就算給你
01/13 17:09, 14F
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01/13 17:09, 5年前 , 15F
挑到了 1 顆正確的，你將來還是不會做 cloning。
01/13 17:09, 15F
推
01/14 04:09, 5年前 , 16F
我覺得很多e coli裡面發生的事情都還未知 多挑幾顆真
01/14 04:09, 16F
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01/14 04:09, 5年前 , 17F
的無妨 我colony pcr一次也都一盤XD
01/14 04:09, 17F
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01/14 10:51, 5年前 , 18F
如果挑出的clone除了on target外容易有off target,是需要
01/14 10:51, 18F
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01/14 10:53, 5年前 , 19F
多挑幾顆,如果都是可預期的no target,怪菌Ecoil是無辜的
01/14 10:53, 19F
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01/14 17:03, 5年前 , 20F
隨手狗了一下 s17是cloning strain沒錯啊 所以B大說得
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01/14 17:03, 5年前 , 21F
對 Ecoli是無辜的
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01/15 08:14, 5年前 , 22F
學生挑20個菌結果我被老闆洗臉…
01/15 08:14, 22F
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01/15 08:15, 5年前 , 23F
我自己是挑6顆，定序送2顆
01/15 08:15, 23F
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01/15 08:16, 5年前 , 24F
可是學生不是我帶的…
01/15 08:16, 24F
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