[求救] lentivirus dual infection

看板Biotech作者 (TATA box)時間6年前 (2018/06/26 22:58), 5年前編輯推噓8(8推 0噓 23→)
留言31則, 9人參與, 5年前最新討論串1/1
各位版大好: 我目前想送兩個螢光fusion protein進去Jurkat T cell 裡面 拍live imaging (一個接GFP, 一個mCherry) 目前是送進去的方法有一些問題: 1.利用電轉染 2. 利用lentivirus 電轉染之前測試的結果 發現兩者同時送入細胞的比例不高，大概10% (可能是條件沒用好電的效率太差，單就轉染效率粗估30%，我是用Biorad-Xcell) 就算有，兩者皆表現適中，適合拿來拍live的幾乎是沒了 而且每次電都要極大量的plasmid 所以目前是傾向用lenti去感染 (至少目前用起來效率較佳，表現較平均) 但目前手上只有一個lenti ovexpression vector (CMV drive的, puro resistent) 我想問說，如果我把兩色的construct都分別接入這個vector 再去感染細胞 (sequential 或同時感染) 應該會導致其中一個表現量被競爭掉? 我是否需要兩種不同promotor drive的vector呢? 還是其實不太影響? 而且同一種vector代表我無法用抗生素篩出同時表現GFP/mcherry的細胞 這也是有點為難的點... 只是中研院的pLAS系列爬以前的文，看起來titer有點低，不知是否該買下去 補: 我的cDNA+螢光蛋白大小: Target protein是3.5k 作為marker protein的序列為1.5~2k不等，但只有一個5.2k的marker 我有點不確定virus能不能送進去 各種的建議都可以 (或是電轉染相關的建議也行) 小的第一次處理T cell，以前養Hela最常用transfect的lipo直接掰掰 有缺的資訊我會盡快補上，還請大家多多提點，謝謝! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 103.224.203.107 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1530025129.A.7D9.html
推
06/27 00:08, 6年前 , 1F
用2A peptide接起來 不然IRES也可以
06/27 00:08, 1F
推
06/27 00:30, 6年前 , 2F
也可試試flow sorting那些double positive cells
06/27 00:30, 2F
推
06/27 04:59, 6年前 , 3F
IRED一票
06/27 04:59, 3F
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06/27 05:01, 6年前 , 4F
IRES XD 用lentivirus dual infection 之前做效果沒
06/27 05:01, 4F
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06/27 05:01, 6年前 , 5F
有說很好
06/27 05:01, 5F
推
06/27 12:52, 6年前 , 6F
IRES+1
06/27 12:52, 6F
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06/27 12:53, 6年前 , 7F
Dual infection的話就還是要兩個不一樣的抗生素，
06/27 12:53, 7F
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06/27 12:53, 6年前 , 8F
自己改也可以
06/27 12:53, 8F
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06/27 13:56, 6年前 , 9F
不推IRES，除了不同細胞表現效率不一樣的問題外，也不
06/27 13:56, 9F
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06/27 13:57, 6年前 , 10F
太能控制前後ORF的表現比例，推薦2A，可以確保 1:1 的
06/27 13:57, 10F
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06/27 13:58, 6年前 , 11F
表現量。你可以 A-EGFP=2A=B-mCherry=2A=PuroR 這樣
06/27 13:58, 11F
https://imgur.com/a/AMu5YH4 圖片是我的Plasmid map 先謝謝大家的建議，但由於手邊的plasmid IRES2後已經接了puro，也沒有其他切位 硬要塞成我的B fusion protein感覺有點難 2A peptide我會研究看看；不過這樣子plasmid總長度會到12k左右 會不會先卡在抽plasmid這步驟囧 另外這樣大的fusion protein不會影響到virus 的效率嗎?
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06/27 17:57, 6年前 , 12F
lenti可以裝更大的
06/27 17:57, 12F
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06/27 18:20, 6年前 , 13F
用 NheI/AgeI 切開 plasmid，把 B-mCherry-2A 塞進去，
06/27 18:20, 13F
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06/27 18:22, 6年前 , 14F
2A的序列只有 60 bp 左右，可以直接加在 primer 上
06/27 18:22, 14F
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06/27 18:23, 6年前 , 15F
我會建議在 A 和 B 兩個 fusion 蛋白上裝 tag，方便用
06/27 18:23, 15F
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06/27 18:24, 6年前 , 16F
於檢查 2A cleavage 效率以及日後如果要檢測蛋白質表現
06/27 18:24, 16F
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06/27 18:24, 6年前 , 17F
時可以用。
06/27 18:24, 17F
推
06/27 21:14, 6年前 , 18F
12k不會影響抽DNA啦, Bacmid 170k都在抽了
06/27 21:14, 18F
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06/27 21:15, 6年前 , 19F
他的mCherry跟GFP就是tag可以檢查囉
06/27 21:15, 19F
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06/27 21:16, 6年前 , 20F
2A的影響會有需要排除嗎?
06/27 21:16, 20F
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06/27 21:29, 6年前 , 21F
對吼EGFP和mCherry就能用抗體認了...我這裡連EGFP都是
06/27 21:29, 21F
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06/27 21:29, 6年前 , 22F
用myc在做western所以沒意識到XD。一般來說2A主要就是
06/27 21:29, 22F
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06/27 21:29, 6年前 , 23F
要檢查cleavage的效率，2A本身序列很短就像tag一樣基本
06/27 21:29, 23F
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06/27 21:29, 6年前 , 24F
上可以忽略。
06/27 21:29, 24F
推
06/28 07:46, 6年前 , 25F
IRES+1
06/28 07:46, 25F
推
06/29 20:41, 5年前 , 26F
2A效率不太好
06/29 20:41, 26F
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06/29 20:42, 5年前 , 27F
切的效率 所以要注意也沒有沒切斷的
06/29 20:42, 27F
抱歉假日比較有空回: X大的建議不錯我會試試看; 至於2A跟IRES目前上網找看好像各有利弊 (前者不一定切的段/後者表現量比較飄) IRES由於切位實在生不出來，而且還要把puro搬家 不是很想把事情弄那麼複雜囧
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06/29 21:30, 5年前 , 28F
先轉一個再sorting 接著再轉第二個 再sorting
06/29 21:30, 28F
推
06/29 22:05, 5年前 , 29F
如果有flow可用,也不用想篩藥的問題了
06/29 22:05, 29F
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06/29 22:06, 5年前 , 30F
兩個一起感染,sorting出滿意的雙螢光細胞即可
06/29 22:06, 30F
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06/29 22:07, 5年前 , 31F
後續還是篩藥,只是拿來保持細胞株用
06/29 22:07, 31F
近期會去學flow，只是我們所上也沒有，得去別人家借 這也是一個比較麻煩的地方 是說我想請問一下，我用lenti infect成的polyconal cells 理論上持續用puro篩藥，就能維持ovexpression gene的表現量了吧? (就不會篩一篩螢光全沒了...我是指細胞沒養太久的情況下) ※ 編輯: tynse71864 (103.224.203.107), 06/30/2018 10:13:38
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