[求救] WBㄧ直壓出白白ㄧ片

看板Biotech作者 (~讓我考上吧~)時間6年前 (2017/11/18 17:40), 編輯推噓10(10推 0噓 23→)
留言33則, 14人參與, 7年前最新討論串1/1
https://i.imgur.com/iTNqMch.jpg
最近WB壓片結果ㄧ直像上圖ㄧ樣。 上膠: 60V 40~50min 下膠:90-100V- -transfer:100V 90min blocking:1hr 1抗 O/N 0.05%TBST wash*4共40min 2抗 1hr 0.05%TBST wash*4共40min 之後ECL就去壓片。 之前用同樣條件都壓的出來, 近期不知道發生什麼事就ㄧ直重覆ㄧ樣的失敗! 我的10X running配方如下圖 https://i.imgur.com/4UbzNJp.jpg
已經ㄧ個星期沒進度了，拜託大家幫我看看哪裡出問題了。 謝謝大家 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 114.34.144.193 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1510998017.A.089.html
推
11/18 17:41, 6年前 , 1F
這時候你需要Positive control, 之前有沒有留樣本?
11/18 17:41, 1F
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11/18 17:43, 6年前 , 2F
把之前的樣本配合現在的再跑一次, 若還是沒有, 抗體
11/18 17:43, 2F
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11/18 17:43, 6年前 , 3F
出問題的可能性較大
11/18 17:43, 3F
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11/18 18:07, 6年前 , 4F
個人不認為一抗有問題，感覺應該是有用不同一抗
11/18 18:07, 4F
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11/18 18:08, 6年前 , 5F
ECL壞的機率比較小，試試看換換2抗?
11/18 18:08, 5F
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11/18 18:09, 6年前 , 6F
膠也有可能有出問題，這都要去試試看才知道
11/18 18:09, 6F
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11/18 18:10, 6年前 , 7F
從右下的圖來看可能是跑完膠就有問題了
11/18 18:10, 7F
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11/18 18:10, 6年前 , 8F
轉染之後染看看 ponceau S Y
11/18 18:10, 8F
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11/18 18:12, 6年前 , 9F
若是真的懷疑buffer有問題就先重配個1L的1X running
11/18 18:12, 9F
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11/18 18:12, 6年前 , 10F
buffer 跑看看就知道了
11/18 18:12, 10F
推
11/18 22:34, 6年前 , 11F
你的actin也這樣嗎
11/18 22:34, 11F
推
11/19 00:10, 6年前 , 12F
需要 positive Ctrl 不然可能性太多了捏
11/19 00:10, 12F
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11/19 08:59, 6年前 , 13F
actin也ㄧ樣這樣，所以才覺得很怪！
11/19 08:59, 13F
推
11/19 10:16, 6年前 , 14F
Marker有transfer ok嗎？
11/19 10:16, 14F
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11/19 12:10, 6年前 , 15F
running的glycine 144g為什麼要劃掉？
11/19 12:10, 15F
推
11/19 12:44, 6年前 , 16F
transfer 的buffer有更新嗎？用太多次轉印效率會變差
11/19 12:44, 16F
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11/19 13:35, 6年前 , 17F
Marker每次都有的轉過去，transfer buffer用reuse
11/19 13:35, 17F
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11/19 13:35, 6年前 , 18F
的我也都會加至少ㄧ半全新的ㄧ起用。running配方我
11/19 13:35, 18F
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11/19 13:35, 6年前 , 19F
也覺得有問題
11/19 13:35, 19F
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11/19 15:43, 6年前 , 20F
runngin buffer這裡,有人用144g,也有用192g,都跟你寫不同
11/19 15:43, 20F
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11/19 15:45, 6年前 , 21F
文章先說marker有跑開,就比較好猜測跟running無關
11/19 15:45, 21F
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11/19 15:45, 6年前 , 22F
另外transfer每次都是半新半舊,應該很少人這麼用吧？
11/19 15:45, 22F
推
11/19 16:11, 6年前 , 23F
Transfer我們都可以用到8次,每次1~1.5hr還是可以做
11/19 16:11, 23F
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11/19 21:30, 6年前 , 24F
transfer buffer全部重配呢？不要用舊的試試看
11/19 21:30, 24F
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11/19 21:31, 6年前 , 25F
之前實驗室發生過marker過去但也壓不出東西，換人配buffe
11/19 21:31, 25F
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11/19 21:31, 6年前 , 26F
r就沒事了
11/19 21:31, 26F
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11/20 15:24, 6年前 , 27F
好，我已重配了！謝謝大家
11/20 15:24, 27F
推
11/20 18:53, 6年前 , 28F
Transfer buffer重配 可能有配錯
11/20 18:53, 28F
推
11/20 23:07, 6年前 , 29F
膠染一下就知道啦
11/20 23:07, 29F
推
11/22 01:21, 6年前 , 30F
你加完ecl到壓片多久？1/2抗品牌和濃度？
11/22 01:21, 30F
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11/22 19:30, 6年前 , 31F
謝謝大家，結果發現是二抗壞掉，感謝大家提供可能
11/22 19:30, 31F
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11/22 19:30, 6年前 , 32F
的錯誤資訊，謝謝。
11/22 19:30, 32F
推
03/27 23:46, 7年前 , 33F
二抗可重配
03/27 23:46, 33F
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文章代碼(AID): #1Q400129 (Biotech)