[求救] TA cloning錯誤insert請教

看板Biotech作者 (ernielwl)時間6年前 (2017/10/03 14:05), 6年前編輯推噓5(5推 0噓 14→)
留言19則, 6人參與, 6年前最新討論串1/1
請教經驗豐富的各位 做TA cloning會常常挑到錯誤的insert嗎 小弟使用RBC TA cloning kit inserts 大小為1.5k，PCR產物經過gel extraction 純化 按照protocol 操作，ligation,transform結果都很好 但是藍白篩挑的白色菌落常常有錯誤insert (藍白篩效果也沒有不好) https://i.imgur.com/JfhE8nL.jpg
我們lab是從藍白篩挑白色菌起來，先在固態ampicillin LB做一次純培養，再到液體ampi cillin LB隔夜 之後用Geneaid mini plasmid kit抽質體 質體由HindIII在37度切30min後跑電泳確認inserts 附上vector map https://i.imgur.com/MEulSGM.jpg
確定HindIII有兩個site可以切下中間的insert 然後切過的質體，常常在500bp,1kb跑出兩個產物，如附圖，34567跑道，第8跑道先前做 好的，正確的對照組 (marker使用100bp plus Dna ladder) https://i.imgur.com/SHhjYE0.jpg
一開始老師以為那可能是insert裡面有HindIII切位，500bp+1k剛好是1.5kb 但是我在基因序列上分析過並沒有HindIII切位 還是有送其中一個sample去定序， 回來的結果經過blastn得到的都是一些vector https://i.imgur.com/hEi56BK.jpg
小弟實在不了解，會產生這些錯誤insert的原因是什麼? 是TA vector自己產生奇怪的自 接嗎？ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 101.8.211.165 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1507010702.A.AFB.html ※ 編輯: ernielwl (101.8.211.165), 10/03/2017 14:07:02 ※ 編輯: ernielwl (101.8.211.165), 10/03/2017 14:10:11
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10/03 15:00, 6年前 , 1F
我會用 M13 forward 和 M13 reverse 去做 colony PCR
10/03 15:00, 1F
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10/03 15:02, 6年前 , 2F
有可能是 vector 有 contamination
10/03 15:02, 2F
我們lab不習慣從colony PCR，boss說會有偽陽性，最後質體還是會抽，用質體出來跑是 最準的 然後我用M13 forward 分別我Insert的 forward, reverse primer去PCR確認，不然M13 F ,R跑出來大小還是一樣1.5kb分不清處 ※ 編輯: ernielwl (101.8.211.165), 10/03/2017 15:08:39
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10/03 18:15, 6年前 , 3F
約1.5k這一段,跟起始作為PCR template也沒有關係嗎？
10/03 18:15, 3F
前陣子做insert只有400~700bp的時候也會出現這段 這次剛好clone 1.5kb的產物所以有一起去定序，真的一點關係都沒有 非常詭異......而且跟vector的序列去alignment也不是100%對到其中一段
推
10/03 19:03, 6年前 , 4F
先colony PCR screening,挑出對的size insert
10/03 19:03, 4F
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10/03 19:04, 6年前 , 5F
再抽plasmid做 RE check
10/03 19:04, 5F
我們跳過colony PCR直接繼續下去RE check，結果來說其實一樣，做起來習慣就好 ※ 編輯: ernielwl (175.96.64.191), 10/03/2017 19:25:51
推
10/03 20:46, 6年前 , 6F
會耶，之前做TA多少會跳到奇怪的clone(定序結果)，所以除非
10/03 20:46, 6F
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10/03 20:46, 6年前 , 7F
不得已，不然不太用TA cloning
10/03 20:46, 7F
推
10/03 20:59, 6年前 , 8F
lane2/345/67/8 ，總共有四種pattern，各拿一個去定序
10/03 20:59, 8F
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10/03 21:03, 6年前 , 9F
我會猜你們的 TA vector 可能混到其他不知名的 vector
10/03 21:03, 9F
Vector都是新買的，每次做都多少會這樣......
推
10/03 21:10, 6年前 , 10F
TA vector不加insert直接transform看看？看看有沒有污染
10/03 21:10, 10F
直接加還是做一個no inserts的ligation controls? 如果測出有問題那這家公司的vecto r品質堪憂QQ ※ 編輯: ernielwl (175.96.64.191), 10/03/2017 22:11:40
推
10/03 23:22, 6年前 , 11F
或許兩種都該試試，天曉得是DNA fragment還是plasmid
10/03 23:22, 11F
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10/03 23:23, 6年前 , 12F
contamination
10/03 23:23, 12F
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10/04 20:17, 6年前 , 13F
有考慮用其他re切切看嗎？還有，能請教你們用什麼做為t
10/04 20:17, 13F
其他RE切沒什麼意義，從一開始挑起來的clone裡面insert就錯了
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10/04 20:17, 6年前 , 14F
emplate嗎？
10/04 20:17, 14F
insert是由cDNA為template PCR出來的，內文有說，會經過一次切膠純化，所以片段大小 不會出錯 ※ 編輯: ernielwl (175.96.64.191), 10/04/2017 21:55:58
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10/04 22:40, 6年前 , 15F
從你放的blast來看,好像是訂序到backbone,也就是pUC19序列
10/04 22:40, 15F
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10/04 22:41, 6年前 , 16F
這1+0.5k不是塞到TA之間,所以應該不是insert污染
10/04 22:41, 16F
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10/04 22:43, 6年前 , 17F
跑個uncut看有insert的比vector only,或許可以看到雜band
10/04 22:43, 17F
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10/04 22:47, 6年前 , 18F
只是這是vector或來自Ecoli的污染,要測過才知道
10/04 22:47, 18F
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10/04 22:51, 6年前 , 19F
我們曾經遇過Ecoli有plasmid污染,就是他們的HIT DH5a
10/04 22:51, 19F
原來如此，看來他們的 HIT DH5a也可能有問題...... 不過我也有用他們這組competent cell 裡面附的 control plasmid，transform出來全部 都是藍色菌落，如果污染到應該也會混白色的 目前推測TA vector裡面污染的可能性比較高 謝謝大家給的建議與回覆! ※ 編輯: ernielwl (175.96.64.191), 10/04/2017 23:46:23
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