[求救] pTWIN1/nruI,bamHI設計primer

看板Biotech作者 (幫幫)時間6年前 (2017/09/05 15:06), 編輯推噓0(0推 0噓 13→)
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想請問一下 因為想使用ptwin1的CBD-Ssp DnaB INT做純化蛋白 但現在在設計引子，設計後覺得引子有點長，R-primer和F-primer的Tm差有點大，想問一 下，我這樣設計到底可不可行。 F-primer(nruI) Tm76 5’- GTC GCG AAT GAC ATC ATT GTA CAC AAC *GGC CGG GCG GGC CGC TTG AAG AAG* -3' R-primer(bamHI) Tm63 5’- CGC GGA TCC TTA *TCT TCC TAG TGC CTG* -3’ (*為target protein 序列*) -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 111.83.57.37 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1504595161.A.8CA.html
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09/05 15:30, , 1F
設計成這樣總有理由,是什麼？
09/05 15:30, 1F
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09/05 16:26, , 2F
1.一般來說要加上切位的話不會額外多加那麼多mer
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09/05 16:26, , 3F
我自己經驗是依不同的enzyme會外加2~4個mer而已
09/05 16:26, 3F
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09/05 16:28, , 4F
若沒有特殊功能，F的7~27bp有什麼特殊的意義嗎?
09/05 16:28, 4F
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09/05 16:29, , 5F
我平均設計約18(CDS)+8(Cutting site+額外保護用)而已
09/05 16:29, 5F
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09/05 16:30, , 6F
再依據CG%調整總長度
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09/06 11:53, , 7F
F-primer的部分GTC GCG AAT GAC ATC ATT GTA CAC AAC (
09/06 11:53, 7F
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09/06 11:53, , 8F
是部分intein包含nruI)後端GGC CGG GCG GGC CGC TTG AA
09/06 11:53, 8F
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09/06 11:53, , 9F
G AAG是GRA+target protein
09/06 11:53, 9F
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09/06 19:00, , 10F
一定要加GRA的話,也可以直接用MCS的NcoI+target gene就好
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09/06 19:01, , 11F
要是完全不要NcoI的ATG,那也可以設計SapI,不一定要NruI
09/06 19:01, 11F
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09/06 19:04, , 12F
只是SapI比NruI貴,雖然這麼長的primer也需要多花純化的錢
09/06 19:04, 12F
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09/06 19:07, , 13F
不過如果gene已經在plasmid上,primer隨便訂也不擔心P不出
09/06 19:07, 13F
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