[求救] 用TRIzol LS Reagent 萃取DNA 品質低落

看板Biotech作者 (Nereus)時間7年前 (2016/12/04 23:41), 編輯推噓2(208)
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各位前輩麻煩指導一下小弟我, 小弟我是化學系而非生科相關科系, 但因為實驗上需要所以有在萃取DNA, 我們樣品都是全血經由kit組萃取, 但後來因老闆的方向,希望在同一樣品萃取出RNA和DNA, 所以選用TRIzol LS Reagent作為萃取試劑。 萃取DNA的步驟是: (前面TRIzol LS Reagent 用 4mL) 1. 之前萃取完RNA後的tube裡面含有中間層及有機層還有殘餘水層去做離心。 2. 離心後去除水相。(會稍微吸掉一些有機層,但也不太確定有沒有完全去除水層。) 3. 加入2mL 100% EtOH (用手上下反覆搖晃均勻,靜置3min。) 4. 離心 2000g, 7min, 4度。 5. 倒掉上層液體,留下沉澱。(這邊沉澱一大坨,很像檳榔渣。) 6. 加入5.5mL的 0.1M sodium citrate in 10% ethanol並震盪使沉澱脫離tube底部。 7. 室溫靜置30min,後離心 2000g, 5min, 4度。 8. 移除液體,留下沉澱。 9. 6~9步驟重複三次。 10. 加入9mL 75% EtOH,搖晃震盪後靜置室溫,20min。 11. 離心 2000g, 5min, 4度,後移去液體留下沉澱。 12. 10~11步驟重複三次。(此時很像檳榔渣的沉澱仍然在。) 13. 真空抽乾5~10min。 14. 加入400 uL 8mM NaOH 回溶。 15. 離心 1200g, 10min, 4度。 16. 把含DNA的液體吸出轉移到新tube。(有用0.22um小飛碟過濾,因為大沉澱還在。) 把液體拿去測吸收算濃度,得到結果如下: http://imgur.com/a/nbZSG 小弟不知道為什麼濃度會如此之高,然後品質如此低落... 實驗室沒有學長姐用TRIzol做過萃取RNA或DNA, 一開始懷疑是否是有機溶劑或鹽類殘留,所以75% EtOH那邊洗了3次, 但是結果還是一樣,整個大崩潰Q-Q... 想請教有經驗的前輩給個指導, 或者是告知我我步驟哪裡錯誤。 謝謝各位。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 218.166.224.4 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1480866114.A.B10.html

12/05 20:42, , 1F
DNA 不夠純啊。步驟5和6之間,可以多一點phenol-chloroform
12/05 20:42, 1F

12/05 20:43, , 2F
的步驟。另外,樣本不夠分成兩半,一半用TRIzol抽RNA,一半
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12/05 20:43, , 3F
用其他方法抽 DNA 嗎?
12/05 20:43, 3F

12/05 23:23, , 4F
同時抽RNA和DNA本來效果就不太好 。最好的就是樓上的
12/05 23:23, 4F

12/05 23:23, , 5F
做法
12/05 23:23, 5F

12/06 17:54, , 6F
trizol抽dna效果本來就很糟
12/06 17:54, 6F

12/07 23:19, , 7F
順帶一提 抽蛋白也不太好
12/07 23:19, 7F

12/08 21:12, , 8F
trizol抽dna效果本來就很糟+1
12/08 21:12, 8F

12/27 16:49, , 9F
Trizol不是主要用於RNA isolation嗎?而且你的步驟也少
12/27 16:49, 9F

12/27 16:49, , 10F
了CHCl3與IPA沈澱
12/27 16:49, 10F
文章代碼(AID): #1OH3b2iG (Biotech)