[求救] 用TRIzol LS Reagent 萃取DNA 品質低落
各位前輩麻煩指導一下小弟我,
小弟我是化學系而非生科相關科系,
但因為實驗上需要所以有在萃取DNA,
我們樣品都是全血經由kit組萃取,
但後來因老闆的方向,希望在同一樣品萃取出RNA和DNA,
所以選用TRIzol LS Reagent作為萃取試劑。
萃取DNA的步驟是:
(前面TRIzol LS Reagent 用 4mL)
1. 之前萃取完RNA後的tube裡面含有中間層及有機層還有殘餘水層去做離心。
2. 離心後去除水相。(會稍微吸掉一些有機層,但也不太確定有沒有完全去除水層。)
3. 加入2mL 100% EtOH (用手上下反覆搖晃均勻,靜置3min。)
4. 離心 2000g, 7min, 4度。
5. 倒掉上層液體,留下沉澱。(這邊沉澱一大坨,很像檳榔渣。)
6. 加入5.5mL的 0.1M sodium citrate in 10% ethanol並震盪使沉澱脫離tube底部。
7. 室溫靜置30min,後離心 2000g, 5min, 4度。
8. 移除液體,留下沉澱。
9. 6~9步驟重複三次。
10. 加入9mL 75% EtOH,搖晃震盪後靜置室溫,20min。
11. 離心 2000g, 5min, 4度,後移去液體留下沉澱。
12. 10~11步驟重複三次。(此時很像檳榔渣的沉澱仍然在。)
13. 真空抽乾5~10min。
14. 加入400 uL 8mM NaOH 回溶。
15. 離心 1200g, 10min, 4度。
16. 把含DNA的液體吸出轉移到新tube。(有用0.22um小飛碟過濾,因為大沉澱還在。)
把液體拿去測吸收算濃度,得到結果如下:
http://imgur.com/a/nbZSG
小弟不知道為什麼濃度會如此之高,然後品質如此低落...
實驗室沒有學長姐用TRIzol做過萃取RNA或DNA,
一開始懷疑是否是有機溶劑或鹽類殘留,所以75% EtOH那邊洗了3次,
但是結果還是一樣,整個大崩潰Q-Q...
想請教有經驗的前輩給個指導,
或者是告知我我步驟哪裡錯誤。
謝謝各位。
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