[求救]PCR一直跑不出來

看板Biotech作者 (胖胖丁仔)時間8年前 (2016/07/04 16:43), 8年前編輯推噓10(10推 0噓 47→)
留言57則, 13人參與, 最新討論串1/1
大家好，實驗室同伴跑PCR一直跑不出來，這實驗曾經一度有做出來過，只是後來不知怎 麼地就一直失敗，持續失敗了半年，也爬過很多文，就是找不出方法。實驗室的學長、助 理(我)都跳進來幫忙做過，因為大家都是這方面的新手，所以一開始一直以為是操作問題 ，所以用相同的條件重複了n次，primer、polymerase也都重買過，還是出不來。後來因 為有了positive control，positive control 都有跑出來，但想要的 gene 就是跑不出 來，而且都有拖帶，希望大家能給一點改善的意見，謝謝！ ------------------------------------------------------------------------------ 我們有 blast 確定設計的 primer 專一性沒問題，也可以夾出要的 gene。 F primer 的長度是36, GC%=44 Tm=64.4 R primer 的長度是37, GC%=54 Tm=68.9 gene大小是 2.8 kb postive control是 2 kb ------------------------------------------------------------------------------ 下面是幾張在有postive control後，跑膠的結果 一開始用的是下面的條件： PCR program： 1. 95’c, 30sec 45~55’c, 30sec 72’c, 2mins (35 cycles) 2. 72’c, 8mins 3. 16’c, hold genomic DNA template ： 50 ng dNTP：500 μM F&R primer：0.5 μM 10x buffer：2 μL sterile DI water：13 μL Pro Taq Plus DNA Polymerase：2 units *total reaction： 20 μL http://imgur.com/psXkP16
---------------------------------------------------------------------------- 爬了一些關於有拖帶的文章，看到了幾個可能原因： 1.template濃度太高 2.dNTP濃度太高 3.primer濃度太高 4.cycle數太多 5.annealing溫度太低 以及有些版友推薦在 reaction 加 1~5% 的 DMSO ---------------------------------------------------------------------------- 所以做了一些改變 PCR program： 1. 95’c, 30sec 2. 95’c, 30sec 50~65’c, 30sec 72’c, 2mins 30sec (30 cycles) 3. 72’c, 8mins 4. 10’c, hold genomic DNA template ： 50 ng dNTP：200 μM F&R primer：0.2 μM 10x buffer：5 μL sterile DI water：40 μL Pro Taq Plus DNA Polymerase：2 units *total reaction： 50 μL http://imgur.com/ywo2Swu
結果還是一樣拖帶....Orz 想請問大家還有其他改善方法嗎？ 是應該在增加DMSO濃度？還是說還是太多cycle嗎？ 版上有看到有些人建議加 Betaine，但因為看到這種解決多是增對 GC rich 的片段，加 上我們實驗室沒有，請問有需要添購嗎？ 拜託大家幫幫忙了!!!!非常感謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.120.93.70 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1467621799.A.2F7.html
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07/04 17:21, , 1F
曾經一樣p不出來，gDNA再稀釋10到100x 產物就出現了
07/04 17:21, 1F
看來稀釋兩三倍太秀氣了，再來試試，謝謝！ 稀釋成 5ng/50μL 結果連postive control 都沒出來了囧
推
07/04 17:24, , 2F
Pro Taq應該是波士特自家的? 你買個管R牌或B牌的HF試試?
07/04 17:24, 2F
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07/04 17:25, , 3F
或者Promega的GoTaq 有時候換Taq跑得出來
07/04 17:25, 3F
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07/04 17:54, , 4F
我們是有用過t牌的 max hot start 也沒跑出來耶，用
07/04 17:54, 4F
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07/04 17:54, , 5F
不推現在的taq是嗎？為什麼 postive contorl出的來
07/04 17:54, 5F
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07/04 17:54, , 6F
，target gene卻出不來呢？不同基因還是會適合不同
07/04 17:54, 6F
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07/04 17:55, , 7F
的polymerase嗎？(新手有點菜sorry
07/04 17:55, 7F
推
07/04 18:01, , 8F
不是不推 ProTaq我以前在120.99用得很開心 問題是有些基因
07/04 18:01, 8F
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07/04 18:01, , 9F
跟霍青桐一樣 "那都是很好很好的Taq，可是我偏不喜歡"
07/04 18:01, 9F
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07/04 18:06, , 10F
了解！再來試試看，謝謝
07/04 18:06, 10F
※ 編輯: pongpongding (111.83.149.104), 07/04/2016 18:10:57 ※ 編輯: pongpongding (111.83.149.104), 07/04/2016 18:17:50
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07/04 18:50, , 11F
DMSO 2,4,6,8,10%都試試
07/04 18:50, 11F
好!! 結果今天試了，都沒成功，10%的在<200bp的地方竟然還出現一條band，不知為何><
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07/04 18:52, , 12F
ampliqon 2x master mix red這個很神，可以用這個試試
07/04 18:52, 12F
目前沒預算，希望用現有的資源試試看，如果還是不行再試試，謝謝提供新資源喔！
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07/04 22:13, , 13F
DMSO+1
07/04 22:13, 13F
推
, , 14F
夾gene是要表現的嗎？建議用proofreading的enzyme
07/05 01:07 是之後要做突變的
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07/05 01:08, , 15F
template是gDNA的話denature可以更高 96~98℃
07/05 01:08, 15F
好謝謝！
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07/05 06:19, , 16F
2.8kb 是包含 intron?
07/05 06:19, 16F
是欸
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07/05 06:21, , 17F
intron內的詭異序列很多。一般建議分段取得再合起來。
07/05 06:21, 17F
一開始其實是用cDNA做，一直失敗才改用quality比較穩定的gDNA，如果改回用cDNA會比 較好嗎？
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07/05 06:25, , 18F
然後，positive control的template也是gDNA嗎？
07/05 06:25, 18F
是，是同一個 template dDNA，謝謝唷 ※ 編輯: pongpongding (114.38.149.138), 07/05/2016 07:49:58
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07/05 10:07, , 19F
要不要用gDNA或cDNA不是取決於你要不要intron嗎？
07/05 10:07, 19F
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07/05 10:08, , 20F
為什麼會說因為quality的考量,來決定用gDNA或cDNA?
07/05 10:08, 20F
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07/05 10:11, , 21F
至於你回答micocat說夾基因是要做突變,所以不用要表現嗎？
07/05 10:11, 21F
其實是因為實驗室同伴的RNA一直抽不好，造成cDNA的quality也備受質疑，所以改用確定 quality比較好的gDNA先確定實驗p不出來是不是primer的問題 ※ 編輯: pongpongding (140.120.93.70), 07/05/2016 10:23:01
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07/05 10:28, , 22F
如果改用gDNA是為了測試primer好不好,那現在data已經顯示
07/05 10:28, 22F
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07/05 10:30, , 23F
不ok,照你們的預期,不就可以認定primer,然後別再試條件了
07/05 10:30, 23F
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07/05 10:31, , 24F
又或者,既然覺得換primer也沒解決問題,也就是問題還未知
07/05 10:31, 24F
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07/05 10:32, , 25F
與其花在gDNA上troubleshooting,應該放心力在cDNA多嘗試吧
07/05 10:32, 25F
恩恩！想想也是，之前想的太草率了，一心只想趕快找出方法p出來，謝謝你耐心回覆～
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07/05 11:31, , 26F
要測primer能不能用建議在同condition下測
07/05 11:31, 26F
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07/05 11:32, , 27F
intron上常有一堆詭異序列P不出來不一定是primer問題
07/05 11:32, 27F
恩恩，我會再從cDNA試試，謝謝。
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07/05 11:37, , 28F
我的建議和B大基本一樣。另外，實驗室有没有別人已抽好的，
07/05 11:37, 28F
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07/05 11:39, , 29F
品質基本令人滿意的cDNA，拿那個當template吧。
07/05 11:39, 29F
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07/05 11:41, , 30F
然後用gDNA去夾，最好先排除有没有pseudogene或多基因問題。
07/05 11:41, 30F
請問一下用blast可以確認pseudogene的問題嗎？謝謝～
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07/05 11:43, , 31F
呃，上述的然後是語氣上的然後，不是指事件。
07/05 11:43, 31F
推
07/05 13:58, , 32F
是說 預算這好解決...跟業代要個5rnx的酵素 來試 應該都會
07/05 13:58, 32F
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07/05 13:58, , 33F
給
07/05 13:58, 33F
原來如此，立馬來找業務，謝謝！ ※ 編輯: pongpongding (140.120.93.70), 07/05/2016 14:48:46 ※ 編輯: pongpongding (140.120.93.70), 07/05/2016 15:01:10
推
07/05 15:58, , 34F
ampliqon原廠可找萬旺，另外我懷疑有幫OEM的有兩個
07/05 15:58, 34F
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07/05 16:01, , 35F
創世紀的Q-Amp 2x ScreeningFire與圖爾思的SuperRed
07/05 16:01, 35F
推
07/05 20:00, , 36F
BTW..有時候P不到 就往外面再設引子看看 說不定是indel
07/05 20:00, 36F
推
07/06 15:11, , 37F
基因序列也會影響，之前我的實驗有個基因約2.5kb，AT比
07/06 15:11, 37F
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07/06 15:11, , 38F
例大概65%，PCR extension溫度用72℃ P不出來，後來找pa
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07/06 15:11, , 39F
per看，extension溫度改用60℃~65℃，annealing時間延
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07/06 15:11, , 40F
長一些1.15 min/1kb就成功了，一樣用protaq，可以參考
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看看
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07/06 21:18, , 42F
5 6年前趕畢業時也一直p不出來，狠下心用master mix就p出來
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07/06 21:19, , 43F
了 好像是跟慧眾買的 (當時因為管帳的學長該該 所以我直接
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07/06 21:19, , 44F
自掏腰包買 記得價錢還不至於太肉痛)
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07/06 21:22, , 45F
不過後來也沒有認真找到底是哪裡出了問題 就是個學長用原本
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07/06 21:23, , 46F
的Taq就p得出來，我就p不出來 卡到陰的狀況
07/06 21:23, 46F
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07/06 23:44, , 47F
自掏腰包這也太恐怖了-.-
07/06 23:44, 47F
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07/07 00:07, , 48F
master mix都不會太貴，幾百元吧，尤其量大的話可壓更低
07/07 00:07, 48F
推
07/07 03:53, , 49F
我的意思是 怎麼樣也不該學生自掏腰包-.-
07/07 03:53, 49F
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07/07 07:56, , 50F
話說學生時期我也掏過腰包買支餵食針測試實驗XD
07/07 07:56, 50F
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07/07 09:25, , 51F
因為博班學長該該叫 反正我重點是"畢業" 懶得花心力去爭
07/07 09:25, 51F
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07/07 09:26, , 52F
不過畢業後 沒用完的我也沒留下來XD
07/07 09:26, 52F
推
07/08 20:39, , 53F
前面幾個cycle 設計更低的溫度看看，我之前這樣就成功
07/08 20:39, 53F
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07/08 20:39, , 54F
了
07/08 20:39, 54F
這幾天忙著趕計畫的實驗還沒重新去抽RNA，感謝上面幾位的建議，我會再好好試試 看～ ※ 編輯: pongpongding (111.83.204.77), 07/09/2016 06:49:07 ※ 編輯: pongpongding (111.83.204.77), 07/09/2016 06:49:32
推
07/12 00:02, , 55F
gene還蠻長的，建議檢查templeteDNA 的quality, 可以的
07/12 00:02, 55F
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07/12 00:02, , 56F
話用好點的kit抽，別用那種含有機溶劑，最後酒精沉澱收
07/12 00:02, 56F
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07/12 00:02, , 57F
尾的。
07/12 00:02, 57F
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