[求救] western band 斷層

看板Biotech作者 (ㄜ)時間8年前 (2016/06/27 19:29), 編輯推噓4(4推 0噓 20→)
留言24則, 6人參與, 最新討論串1/1
各位高手們好，魯妹最近在趕畢業無奈western狀況連連，請大家幫幫忙 我的目標蛋白是FAS 273kDa, internal control是tubulin 50kDa,牌子都是cell signal 的，抗體分別稀釋1000x和5000x 條件是：8%下膠 上膠4% running:80V 跑160min transfer buffer用10%meOH,400mA 跑150min冰浴放冰包 但結果都是這樣，以下是二重複，左右同一片膠 http://i.imgur.com/RuDbd2e.jpg
本來以為是sample再煮蛋白時溫度不夠高，但後來重新製備後FAS還是高高低低的 之前同學用一樣的條件都有壓出來，但我就是無法QQ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 223.140.93.89 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1467026997.A.E0E.html
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06/27 21:57, , 1F
是running buffer 溢出來嗎？
06/27 21:57, 1F
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06/27 22:35, , 2F
沒有漏喔
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06/27 22:37, , 3F
你在跑的時候 Dye 長怎樣？
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06/27 22:39, , 4F
dye是正常的直直的跑下來
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06/27 22:49, , 5F
你收一個大量的 sample，然後把這個 sample load 到除
06/27 22:49, 5F
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06/27 22:50, , 6F
了 marker 的 9 個 lane 裡跑跑看，如果 9 個跑一樣位
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06/27 22:50, , 7F
置，那就不是 gel 的問題，可能你的 sample 有 degrade
06/27 22:50, 7F
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06/27 22:51, , 8F
或是這個蛋白直本身就會被裁切或修飾
06/27 22:51, 8F
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06/27 22:54, , 9F
欸不對，連 tubulin 都有歪斜.....
06/27 22:54, 9F
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06/27 22:55, , 10F
你請做的出來的人幫你做 gel 給你跑跑看，如果還是有問
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06/27 22:55, , 11F
題那應該是你的 sample 處理有狀況
06/27 22:55, 11F
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06/27 22:57, , 12F
所以不會是機器的問題嗎？電壓不穩或transfer過頭了？
06/27 22:57, 12F
推
06/28 00:16, , 13F
sample怎麼收的?
06/28 00:16, 13F
推
06/28 00:18, , 14F
另外..marker合一下可能可以給更多資訊
06/28 00:18, 14F
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06/28 01:36, , 15F
抱歉marker沒有附在上面
06/28 01:36, 15F
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06/28 01:37, , 16F
右邊圖上面被拉開的band是310kDa 下面的band是270左右
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06/28 01:41, , 17F
sample是PBS wash後加lysis buffer用刮板刮下來高速離
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06/28 01:41, , 18F
心取上清液，定量完加DTT跟dye以98-100度乾浴五分鐘後存
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於負20
06/28 01:41, 19F
推
06/28 14:34, , 20F
可能有兩種原因，樣品鹽濃度太高或不一致和DNA太多樣品
06/28 14:34, 20F
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06/28 14:34, , 21F
太黏。
06/28 14:34, 21F
推
07/02 09:44, , 22F
有試過不凍直接跑嗎
07/02 09:44, 22F
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07/02 16:16, , 23F
sample是都會凍要跑時才回溫..
07/02 16:16, 23F
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07/02 16:16, , 24F
會試試看大家說的方法的真的很感謝各位高手們
07/02 16:16, 24F
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