[求救] ligation失敗

看板Biotech作者 (陰雨綿綿)時間8年前 (2016/06/08 15:29), 8年前編輯推噓11(11推 0噓 23→)
留言34則, 18人參與, 最新討論串1/1
各位好 最近在做一個clone 但是轉型後 一直沒有長出菌落 勝任細胞是使用市售的DH5a 因此懷疑應該是ligation的部分出問題 以下是我做的條件 vector大小為5400 bp insert大小為1000 bp 兩者 RE 剪切完後clean up vector 濃度為 23.5 ng/ul insert 濃度為 10.5 ng/ul 使用I:V=3:1的比例去接，vector加入的量訂為100ng insert 6 ul vector 5 ul ligase 1 ul 10X buffer 2 ul ddH20 6 ul _____________________ 20 ul ligation的時候，會先將除了ligase外的，先以45度加熱5分鐘 之後再加入ligase 有嘗試過(1)4度 O/N (2)16度 1.5 hr → 4度 O/N 最後用 5 ul 加入勝任細胞做轉型(因為>6K，所以有做heat shock) 結果一顆菌落也沒有長... 我們ligation buffer買來就有分裝成小管 每次要用才拿一管出來 因此應該沒有反覆冷凍解凍壞掉的問題.... 請問 (1)是我insert和vector加的量太少嗎?還是應該提高I:V比例(1:5 or 1:7)? (2)還是我ligation的的時間/溫度不對? 另外想問 如果ligation有剩下的 可以放到-20下次再拿出來直接轉型使用嗎? 先感謝各位的幫忙 > < -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.121.155.195 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1465370987.A.3F7.html
推
06/08 15:45, , 1F
我vector濃度都大概1.x ng/ul
06/08 15:45, 1F
→
06/08 15:45, , 2F
你用的抗生素？盤子抗生素濃度？
06/08 15:45, 2F
我是使用kanamycin 30 ug/ml
→
06/08 15:53, , 3F
可以嘗試16度overnight
06/08 15:53, 3F
推
06/08 15:54, , 4F
ligase buf.裡面有ATP不要去加熱！效率會變很差
06/08 15:54, 4F
→
06/08 15:55, , 5F
另外，12-16度overnight會比較好～
06/08 15:55, 5F
加熱是老師給的建議，說他以前的做法 好 我會改試試看16度 O/N
→
06/08 16:04, , 6F
跟別家做的出的借一下ligase，有時候活性有差
06/08 16:04, 6F
LAB其他人也都用同樣的東西做 但是有成功><.... ※ 編輯: angel810801 (140.121.155.195), 06/08/2016 17:43:13
推
06/08 17:47, , 7F
heat shock後有放培養箱recover嗎？有試過把20ul全下嗎？
06/08 17:47, 7F
市售的protocol沒有寫放培養箱recover....我下次試試看 因為他是建議加入的DNA量不要超過1%(一管是100ul) 加上之前我們老師也是說最多不能超過5 ul 20 ul 全加不會給勝任細胞太多壓力嗎? ※ 編輯: angel810801 (140.121.155.195), 06/08/2016 17:50:37
→
06/08 18:48, , 8F
同一樓看法,Kan仍建議recover;DNA方面5-10%就好,20太多了
06/08 18:48, 8F
→
06/08 18:51, , 9F
不過ligation與其補水,而且才用5ul,不如控制體積10ul以內
06/08 18:51, 9F
推
06/08 20:38, , 10F
我大部分都放室溫一個小時跟勝任細胞10:50
06/08 20:38, 10F
推
06/08 21:13, , 11F
kan的菌要recovery+1, 然後我以前ligation是在室溫3-4小時（
06/08 21:13, 11F
→
06/08 21:13, , 12F
隔壁學姐室溫1小時），給你參考
06/08 21:13, 12F
→
06/08 21:17, , 13F
量多沒好處, ligase一般都建議vector 50ng當基準調整
06/08 21:17, 13F
→
06/08 22:49, , 14F
跑個膠確認一下ligation的效率！
06/08 22:49, 14F
→
06/08 23:07, , 15F
跑膠? 以10^7效率看1ng就有1萬顆了,1ng跑膠看得到?
06/08 23:07, 15F
→
06/08 23:11, , 16F
transform長起來的DNA量,遠少於跑膠偵測的靈敏度極限阿
06/08 23:11, 16F
→
06/09 04:59, , 17F
試試ligation完加熱一下，某種程度上可增加transform效率
06/09 04:59, 17F
推
06/09 12:33, , 18F
先前也遇到ligation完全沒長(kanamycin),後來步驟多了LB
06/09 12:33, 18F
→
06/09 12:34, , 19F
加入後，置放37度45分鐘就有長了
06/09 12:34, 19F
推
06/09 15:59, , 20F
我用Quick ligase, 室溫15分鐘就好了
06/09 15:59, 20F
→
06/09 16:00, , 21F
如果vector沒有做切膠分離, 完全沒長肯定是ligase
06/09 16:00, 21F
→
06/09 16:01, , 22F
或是沒有recover的關係, 參考產品protocol去做就好,
06/09 16:01, 22F
→
06/09 16:01, , 23F
先不要用一些其他的經驗去操作
06/09 16:01, 23F
推
06/09 23:55, , 24F
recovery +1 ligation 有這步比較好長～ 趕時間大概15
06/09 23:55, 24F
→
06/09 23:55, , 25F
-20分鐘就行了
06/09 23:55, 25F
推
06/10 01:21, , 26F
學姊我在這（舉手）
06/10 01:21, 26F
→
06/10 01:33, , 27F
不要用cleanup改跑膠切膠純化試試
06/10 01:33, 27F
→
06/10 01:41, , 28F
insert與vector以65度加熱5分，冷卻後再加ligase與buffer
06/10 01:41, 28F
→
06/10 01:41, , 29F
試試
06/10 01:41, 29F
→
06/10 01:43, , 30F
insert我通常會給多一點
06/10 01:43, 30F
推
07/06 13:43, , 31F
勝任細胞體積多少? 加了5uL ligation product 已經很多了
07/06 13:43, 31F
→
07/06 13:45, , 32F
Kna一定要recovery不然效率會很差, heat shock之後加SOC
07/06 13:45, 32F
→
07/06 13:45, , 33F
37度搖一個小時吧, plate也37度C先溫一下
07/06 13:45, 33F
推
07/12 22:39, , 34F
我自己還會額外加ATP>< 怕buffer的沒用了
07/12 22:39, 34F
‣ 更多 angel810801 的文章
文章代碼(AID): #1NLybhFt (Biotech)