[求救] WB 背景超黑

看板Biotech作者 (Alice)時間8年前 (2016/05/17 21:57), 8年前編輯推噓6(6推 0噓 31→)
留言37則, 15人參與, 最新討論串1/1
原po是WB 新手，最近壓一個蛋白，在相同條件下: 40 ug 蛋白量跑膠 ; transfer 320mA 2hr ;用5%脫脂牛奶 blocking 1hr ; 用TBST 洗5m in 一次後加一抗; 一抗1000倍(用5%BSA稀釋)4度overnight ;用TBST洗3次5min ; 加二抗 10000倍); 用TBST洗3次5min後壓片。 但有時後背景乾淨，有時後背景超黑(整片黑那種),請問會是什麼問題呢? 目前只有sampl e不一樣，其他條件大致一樣 , 會是跑膠或是transfer的問題嗎? 我壓其他的蛋白ex: ac tin 背景都很乾淨，卡了好久，希望大家幫幫我 QQ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 36.230.162.35 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1463493470.A.980.html
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上完抗體後，wash時間跟次數？
都是5min,3次 05/17 22:36
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blocking的時間呢？
都是一個小時 05/17 22:55
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配一抗有沒有加牛奶或BSA?
一抗是用5%BSA 05/17 23:01 ※ 編輯: kuyar (36.230.162.35), 05/17/2016 23:10:10
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發文說明明明有寫"請將實驗的步驟、所用的條件大致列出"阿
補充了!!05/17 23:13 ※ 編輯: kuyar (36.230.162.35), 05/17/2016 23:23:37 ※ 編輯: kuyar (36.230.162.35), 05/17/2016 23:24:12
推
05/18 06:10, , 5F
有沒有多load一個必定成功的來做對照組?
05/18 06:10, 5F
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05/18 06:11, , 6F
因為如果blocking沒問題 antibody也是一樣的 那有時黑
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05/18 06:11, , 7F
有時乾淨有沒有可能是因為你的sample的訊號強度不夠
05/18 06:11, 7F
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05/18 06:13, , 8F
造成相對的髒?不過你壓片時間都一樣這樣也怪怪的
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05/18 06:14, , 9F
如果可以 把成功的圖跟失敗的圖貼上來或許更容易有解答
05/18 06:14, 9F
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05/18 08:17, , 10F
二抗我是用20000X稀釋 加在TBST含5%牛奶中一小時
05/18 08:17, 10F
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TBST wash都10min 二抗濃度太高而sample訊號又弱的話
05/18 08:18, 11F
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05/18 08:21, , 12F
二抗很容易亂接 但訊號強的在二抗時我就不會再加牛奶了
05/18 08:21, 12F
推
05/18 17:34, , 13F
試試:1.洗更多次點或延長時間 2.降低二抗至2萬倍甚至更低
05/18 17:34, 13F
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05/18 17:35, , 14F
另外1抗有時也會有影響 poly會比mono髒 但你是背景全出來了
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05/18 17:41, , 15F
也有可能抗體會亂黏(雜質或濃度高)參考data sheet的建議看看
05/18 17:41, 15F
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05/18 18:15, , 16F
40 ug好像有點太高了耶 我都用2ug/well就很夠了
05/18 18:15, 16F
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05/18 21:45, , 17F
樓上要看抗體強度
05/18 21:45, 17F
推
05/18 22:06, , 18F
total protein 20-50ug應該都可接受
05/18 22:06, 18F
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05/18 22:09, , 19F
二抗有時我用1:4000,背景也還好(不過要看牌子,有些真的
05/18 22:09, 19F
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05/18 22:10, , 20F
很髒),我認同sample表現量低(所以拉高曝光時間造成背景
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05/18 22:10, , 21F
髒),或者wash不夠(轉速不夠或時間不夠久)
05/18 22:10, 21F
推
05/18 22:34, , 22F
你一抗用多少體積阿? 是用雜合袋嗎?
05/18 22:34, 22F
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05/20 10:33, , 23F
據個人經驗,可能一抗濃度太高,可以考慮再多稀釋一點
05/20 10:33, 23F
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05/20 10:35, , 24F
blocking milk可以過濾,避免雜質卡在membrane
05/20 10:35, 24F
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05/20 10:36, , 25F
另外抗體是poly clone或mono clone,壓出來品質會差很多
05/20 10:36, 25F
推
05/22 12:28, , 26F
我的經驗上,背景黑色帶點狀的一般是一抗過高
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05/22 12:28, , 27F
黑色雲霧狀的是二抗過高, 多loading會造成整條很強
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05/22 12:28, , 28F
但不至於背景太髒
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05/22 12:29, , 29F
Wash可以拉長,抗體可以在4度作用都能減少背景值
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05/22 12:30, , 30F
但目前的狀況很像是二抗每次配不一樣造成的,盡量用
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05/22 12:30, , 31F
pipet的方式精準配出二抗才有助於抓濃度
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05/31 10:10, , 32F
同一種二抗,看要不要一起在同一杯beaker 2%牛奶配,再利
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05/31 10:10, , 33F
用攪拌子攪拌,二抗會分布較均勻,而不會只集中在一個地方.
05/31 10:10, 33F
推
06/15 02:26, , 34F
因為沒有看到圖 幾個簡單的建議你可以試試 全程用5%BSA
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06/15 02:27, , 35F
或Milk 我試過BSA可以 Milk出大問題的 第二個換一家二抗
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06/15 02:28, , 36F
或用原本二抗+同sample memb剪幾條 2倍2倍titrate看看
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06/15 02:29, , 37F
3 換包底片...在想該不會是底片不小心被曝光過了吧
06/15 02:29, 37F
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