[求救] HMW protein detection

看板Biotech作者 (TATA box)時間8年前 (2016/05/08 23:12), 8年前編輯推噓1(1推 0噓 28→)
留言29則, 4人參與, 最新討論串1/1
版大們晚安 小弟最近在處理一個~250kDa的protein 但western一直都壓不太出來....(以下會詳述) 有逛了一些討論版 但還是做不太出來/很醜 因此想上來請問一下大家的看法 1. 由於我的protein是lipo外送的 理論上量會很多 (以前paper也很多人做過) 我是想問 如果我今天送一樣量 (ex:10ug的DNA) 一個是表現10kDa的蛋白 一個表現250kDa 兩個表現量會有差別嗎? (還是一定要考慮protein的modification) 2.Cell lysis 目前是用0.2% NP40 lysis bfr做 學長之前做出來的條件 rocker 轉+ vortex 15min (會太短嗎? ) 也因為此protein會secrete, condition medium會外加至0.2% NP40 & 1mM PMSF 去掉cell debris後放冰上 之後Lysate 跟medium 做IP o/n, wash三次後加2x smp bfr 煮 (有試過不IP直接跑 看不到一點痕跡 別的實驗室做此protein, 即便是外送 都還是會IP 所以照做) 3.SDS-PAGE 我之前是跑4%的gel 但我上膠是5%.... 這會影響嗎? (跑出來是歪歪扭扭的沒錯 但想確認； pH上6.8下8.8) 跑膠條件: 90V 約2hr ( Biorad tetra cell system) Running bfr 是tris-Glycine SDS (就一般用的) Marker是Thermo 的Spectra MR (Max 300kDa) PS 此情況下 marker位置準嗎? 4.Transfer 條件是根據討論版的結論測的 125mA 120mins Transfer bfr: Tris-Glycine / 10% MeOH / 0.05% Tw20 (建議SDS或tw20或不加的都有,我就用較weak的) transfer完後 marker都有過去 後續處理就是一般的western方法 之前做到130kDa的protein都沒問題 (抗體的部分 因為我學長壓的出來 所以應該不是這問題 但跟一般100kDa以下的壓出來算是不太好看 ) 就這個250的一直壓不出來... 希望大家能給一些意見~~ 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 36.228.136.116 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1462720320.A.33E.html
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05/08 23:19, , 1F
如果,一個protein沒有特殊理由都得先IP才能用WB偵測,那表
05/08 23:19, 1F
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05/08 23:22, , 2F
示抗體有根本的問題:請先了解抗原-抗體特色,與IP的目的
05/08 23:22, 2F
因為不只我們實驗室啦@@...10幾年前的paper~最近 用Hela/COS-7做外送 還是會先用IP enrich (或是TCA 沉澱) 而且抗體跟我們家現在用的不同隻 我也想過這東西真的有少到一定要IP嗎 所以才有 1. 的問題 但我要認真想一下我家抗體是不是壞掉...囧
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05/08 23:26, , 3F
我做3,400kd才用6-7.5%PAGE,250kd而已的大小不太是問題
05/08 23:26, 3F
目前也正改用6% gel 想請問一下B大的跑膠及transfer條件是?
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05/08 23:39, , 4F
你內容說學長做的出來,那應該先問他?(還是又畢業離開了?)
05/08 23:39, 4F
還在XD 但他習慣跑大片膠 我不太會處理大片的 所以跑小的 因此跑膠condition有些差異 剩下基本上是完全發樓
推
05/09 01:15, , 5F
1當然會有差, plasmid的量決定在鹼基多寡, 兩者
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05/09 01:15, , 6F
大小差這麼多, plasmid個數根本不能相比
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05/09 01:17, , 7F
有點口誤, DNA的量決定在鹼基多寡, plasmid的量就需
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05/09 01:17, , 8F
要考慮到質體的大小, 同樣10ug, 10kDa的絕對比
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05/09 01:18, , 9F
250kDa的表現質體多非常多個,表現量就會少很多倍了
05/09 01:18, 9F
J大說的就是我一開始想的點...
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05/09 12:13, , 10F
用plasmid多寡來解釋表現量看似合理,但如果不是以定量RNA
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05/09 12:14, , 11F
而是WB,不同的抗體是無法證明表現量差異
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05/09 12:18, , 12F
而且實際算一下plasmid,100bp跟5.5bp,看似差55倍,但如果接
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到pcDNA3上,一個copy變成5.6k與11k的差異,只差兩倍而已
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05/09 12:21, , 14F
或許不同長度的轉錄效率,比plasmid的copy差異還大很多
05/09 12:21, 14F
謝謝b大 你順便幫我解決了一個快兩年的問題.... 那假若我今天在兩個protein後都接Flag 並用flag 做western 應該可以解決抗體的問題?
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05/09 15:44, , 15F
WB不容易測到，除了抗體問題，還有可能從一開始就有問題啊。
05/09 15:44, 15F
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05/09 15:46, , 16F
Plasmid Seq 壞了，Transfection 效率差(你的對照組如何？)
05/09 15:46, 16F
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05/09 15:47, , 17F
跑膠時的量——大片膠不難搞，你應該學著如何建。
05/09 15:47, 17F
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05/09 15:49, , 18F
既然以前很多人做過，那蛋白修飾問題應該不是影響你結果的主
05/09 15:49, 18F
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05/09 15:50, , 19F
要因素。另外，目標細胞的狀態也有可能會影響結果。
05/09 15:50, 19F
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05/11 12:48, , 20F
先謝謝各位 這幾天想了一下後再來板上回應
05/11 12:48, 20F
plasmid跟seq都是對的喔 Hela transfect大概6~7成,細胞狀態應該OK 其實大膠我會 就只是單純覺得如果小膠可以 為何不能跑小的就好 (因為就看一條band) ※ 編輯: tynse71864 (36.225.70.25), 05/13/2016 12:23:00
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05/13 19:17, , 21F
想這樣比較表現量還是從RNA著手;同一construct把tag接N或C
05/13 19:17, 21F
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05/13 19:21, , 22F
抗體偵測都可能不同了,何況不同蛋白變因更大
05/13 19:21, 22F
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05/13 19:25, , 23F
如果是同construct的delete或mutation,應該就方便這樣比較
05/13 19:25, 23F
因為我的 wt跟 mutant protein， 每次外送 結果表現量都不一樣多 (但 wt一定比較多,只是看多幾倍)； 但試過接 flag後外送, IB Flag 表現量就會一樣。 抗體是bacteria recombinant wt protein打兔子來的 ※ 編輯: tynse71864 (42.73.20.24), 05/13/2016 20:29:34
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05/13 20:31, , 24F
我會在 check 看看,非常感謝
05/13 20:31, 24F
※ 編輯: tynse71864 (1.171.39.66), 05/15/2016 11:18:41
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05/15 22:39, , 25F
大片跑下來，大MW可以比較漂亮的。你確定只會有一條band?
05/15 22:39, 25F
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05/15 22:43, , 26F
wt和mt表現量差到兩倍以上，不是就足以讓你們探討其中的問題
05/15 22:43, 26F
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05/15 22:46, , 27F
了嗎？會不會是穩定性變低了，或對細胞很不友善？XDD
05/15 22:46, 27F
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05/15 23:16, , 28F
好像越看不懂了,前面講HMW壓不到,後面又可以看到wt,mt差異
05/15 23:16, 28F
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05/15 23:18, , 29F
會不會你只是mt表現的問題,就無關跑膠至WB的過程了阿
05/15 23:18, 29F
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