[求救] 解決置換buffer而蛋白沉澱

看板Biotech作者 (handsome)時間8年前 (2016/04/16 14:49), 8年前編輯推噓5(5推 0噓 10→)
留言15則, 6人參與, 最新討論串1/1
我的目標蛋白是從大腸桿菌破菌得到，藉由NI-NTA純化，最後用elution(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,250mM imidazole,pH 4)洗出蛋白，因為最後要置換成PBS(pH 4)，所以 elution直接調成pH4而不是8，我的PBS是以50mM NaH2PO4 + 150mM NaCl與50mM H3PO4 + 150mM NaCl互相調至pH 4，那是以濃縮管進行至換，可是置換後蛋白會有白色沉澱出 來，所以想請問大家由何種方法可以解決，我後續要用pH 4環境作用，ph無法辨更， 感謝大家的解答 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.120.104.80 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1460789397.A.74D.html
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04/16 16:45, , 1F
好奇一問,PBS如其pH buffer功能,如何調到pH=4?
04/16 16:45, 1F
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04/16 17:53, , 2F
這個應該是指一般的PB solution而不是saline。我猜可能是pH
04/16 17:53, 2F
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04/16 17:59, , 3F
變化太快？能用pH梯度緩緩替換嗎？pH 8 --> pH 4。
04/16 17:59, 3F
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04/16 18:10, , 4F
還有你的目標蛋白需要金屬離子來構形的話，可能也會有些問題
04/16 18:10, 4F
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04/16 18:10, , 5F
另外，有時候換換 His-tag 的位置會有不同效果。
04/16 18:10, 5F
推
04/16 19:22, , 6F
算PI... 不行就去找PI
04/16 19:22, 6F
elution已經用pH 4來洗出蛋白，我再置換pH應該不會變化太大? 蛋白pI是5.23 ※ 編輯: bill00202000 (140.120.104.80), 04/16/2016 20:04:36 ※ 編輯: bill00202000 (140.120.104.80), 04/16/2016 20:06:04
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04/17 00:25, , 7F
改成透析膜看看，有的蛋白對鹽濃度敏感，也可考慮+DTT
04/17 00:25, 7F
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04/17 00:26, , 8F
透析膜O/N緩速置換溶液
04/17 00:26, 8F
推
04/17 03:57, , 9F
pH4 PB的緩衝不好看要不要換其他buffer
04/17 03:57, 9F
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04/17 03:57, , 10F
比較穩定
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推
04/17 08:23, , 11F
如果mwco許可dialysis應該是最安全 不然centricon濃縮
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04/17 08:23, , 12F
稀釋循環也可以 比較費工一點就是了
04/17 08:23, 12F
推
04/17 08:27, , 13F
忽然想到 如果透析8->4 經過pI 蛋白會不會掉出來啊
04/17 08:27, 13F
推
04/17 20:48, , 14F
5.3差一個pH log 可能不夠力 試試正常3.0~3.5 elute再滴回
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04/17 20:48, , 15F
4看看? 真的不行的話改回imidazol試試?
04/17 20:48, 15F
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