[求救] lactococcus lactis electroporation
各位版大好
小弟最近在做L.lactis的電穿孔實驗
不過不知道為何質體一直打不進細胞中 在培養基上只會有一層淡白色菌液 沒有菌落出現
如果刮取一點菌液塗到沒有抗生素的培養基上 約16~18hr 就會有滿滿的菌落出現
跟老師討論的結果 他說細胞還活著 但質體沒有打進去
他也不知道怎麼回事 因為他在美國做過相同的實驗
都很順利的在兩天內長出菌落出來
所以想問問各位版大的意見
實驗方法是以L.lactis MG1363 製作勝任細胞
第一天養在含有glucose(碳源) glycine(抑制細胞壁) sucrose(穩定滲透壓)的M17培養基
第二天以相同的培養基做100倍放大培養至OD0.3~0.5(約10E+08 CFU/ml)
之後以glycerol+sucrose的washing buffer在4度C清洗3次
最後以1 ml的washing buffer resuspend 分裝存於-80度
在執行電穿孔時是用2mm cuvette(預冷) ,50ul cell , ~300ng/ul DNA
以2.25KV 50uF 嘗試過129與246的電阻 沒有電弧產生
回復液是M17+glucose+sucrose+CaCl2+MgCl2(預冷) 在32度C回復2小時
取約100ul塗在含有Chloramphenicol(5ug/ml)的SGM17 plate上
DNA的來源是老師從美國帶回來後先以heat shock法打入E.coli DH5α中保存再抽出
在美國則是以E.coli JM109保存 質體大小約10kb 帶有CM resistant
謝謝各位
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.124.50.175
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1456821304.A.718.html
→
03/19 11:18, , 1F
03/19 11:18, 1F
→
03/19 11:18, , 2F
03/19 11:18, 2F