[求救] western 壓片背景值太高

看板Biotech作者 (押比)時間8年前 (2015/08/05 16:26), 編輯推噓3(3推 0噓 27→)
留言30則, 5人參與, 最新討論串1/1
麻煩各位幫忙trouble shooting!!! 已爬過之前的文章，也嘗試之前的方法，但我western壓片結果還是很髒！ 樣品為小鼠肝臟 protein loading量為40ug 體積10-15uL running條件上膠60V 下膠80V 室溫 transfer(濕式)條件為400mA 120min 埋冰 使用0.45孔徑PVDF blocking為Genetex blocking buffer 使用前回到室溫後再blocking 30min wash是使用Millipore SNAP i.d.2 http://imgur.com/1Acr2hv
將TBST倒入方格中wash 一抗1:1000 4度C overnight (MMP-9為Cell signaling MMP-2為St John's Laboratory) 二抗1:10000 室溫 10min (Genetex rabbit) ECL為Millipore 瀝掉多餘的ECL後再去暗房壓片 壓片為傳統手洗壓片 其中配制電泳膠的溶液全部都已經重新配過，上膠下膠ph值皆正常(上：6.8，下：8.8) 壓片結果圖 http://imgur.com/vM127W2
http://imgur.com/TqagQqc
lane的痕跡非常明顯，定量會有困難。 再麻煩大家幫忙了!!!萬分感謝!!!!!!!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 42.78.235.164 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1438763177.A.0D8.html
推
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block改1hr?
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08/05 20:25, , 2F
然後1抗dilute在blocking bfr裡
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推
08/05 20:28, , 3F
另外genetex bfr是哪個啊？ 1%BSA還是5%牛奶
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前者會比較髒一點
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08/06 10:07, , 5F
blocking 改1hr 但還是一樣QQ
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Blocking buffer 是genetex commercial 的產品~不是
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BSA也不是牛奶~~
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謝謝你幫忙！請問還有哪裡可以改進嗎?
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是用SNAP id2,為什麼protocol不像它號稱的時間跟步驟?
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會問你是用可能比較髒的BSA或milk,應該是需要考慮換一下
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blocking bf,還是已經買了commerical就只能改blockin時間?
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因為之前用SNAP id2 建議的下去做，但壓片時間會拉
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長非常久（20min以上），又抗體一定要溶在0.5%milk
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in TBST，可是壓出來的band好像沒有比溶在的5%BSA
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那麼清楚，所以就還是ㄧ抗in BSA overnight 。block
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ing buffer 的話是已經買了，前一陣子壓出來的都乾
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淨清楚，這次就突然都一直出現明顯的lane，才想說
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請大家幫忙看看可能還有哪些問題我沒想到的，可以再
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做改進！
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也再想說是否要改回使用milk blocking會不會比較好
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換一支純化過的二抗，應該會有幫助改善
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請問V大 純化過的二抗是指什麼啊？？？
08/06 15:59, 22F
推
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試試用tritonx100 0.3或0.5% 背景比較低 但signal也會
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相對低 還有試試preabsorbed的一抗
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你仔細看二抗，有的會標示辯識的Ig部位，我之前發現過
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同樣抗mouse的二抗，H+L/L/H/Fab 這幾種呈現的背景會有差
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在做ELISA的時候更明顯
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另外，在抗體的data sheet上通常也會說明是否經過純化
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你先看一下目前在用的二抗是什麼，再挑另一支其他的用用看
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08/15 18:02, , 30F
謝謝大家!!!我再試試看!!!
08/15 18:02, 30F
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