[求救] plasmid中特定基因片段置換?

看板Biotech作者 (殞落星痕)時間9年前 (2015/05/01 11:28), 9年前編輯推噓6(6推 0噓 26→)
留言32則, 9人參與, 最新討論串1/1
最近boss想做一個project 主要是研究某段基因對於藥物抗性的影響 實驗中用到的質體 屬於T5 promoter 其中的antibiotic resistance gene屬於Amp resistance 但本身我們在做Drug resistance的目標也是Beta-lactam 篩選所使用的抗生素會影響實驗結果 想把amp 抗性換成 其他抗生素篩選基因 苦於小弟沒做過mutagenesis... boss也不太願意添購新的plasmid 想請問一下板上先輩，有甚麼方向可以嘗試? 可以點出，小弟再去搜搜看相關文獻方法來嘗試! 感謝各位提點 祝各位順順利利的~實驗也都有好Data!!! -- 教授念經何時了 靠妖期末考 室友昨夜又春風 好人不堪回首數卡中 學長筆記應猶在 只是課本改 問吾能有幾多囧 不多不少正好五十九 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 163.20.181.88 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1430450924.A.1C5.html
→
05/01 11:49, , 1F
實驗室有抗其他抗生素的plasmid嗎，拿來換一換就好了
05/01 11:49, 1F
推
05/01 11:51, , 2F
查有沒有適合的酵素切位把amp gene切掉 接別的進去就好
05/01 11:51, 2F
有Kanamycin、chloramphenicol的抗性載體 amp resistance前方緊黏T5 promoter 還是只要把AMP部分截掉就好了?? ※ 編輯: babylikeg (163.20.181.88), 05/01/2015 12:03:02
推
05/01 15:01, , 3F
沒RE的話可以設計homologuous recombination換進去
05/01 15:01, 3F
→
05/01 15:02, , 4F
但要在特殊E. coli strain
05/01 15:02, 4F
推
05/01 15:11, , 5F
先把map調出來 ，應該會有可切掉amp的位置 ，切掉後由
05/01 15:11, 5F
→
05/01 15:11, , 6F
其他plasmid的抗生素片段來塞進去
05/01 15:11, 6F
→
05/01 15:12, , 7F
切掉amp部份就可以 ，T5不用
05/01 15:12, 7F
→
05/01 17:23, , 8F
我想到的是類似 liuse 的作法：將Amp vector 和要製換的XXX
05/01 17:23, 8F
→
05/01 17:24, , 9F
vector 放在一起。設計 forward primer 前半段在 amp vector
05/01 17:24, 9F
→
05/01 17:25, , 10F
上，後半段在 xxx 抗生素的 5'-end 上，然後 reverse primer
05/01 17:25, 10F
→
05/01 17:26, , 11F
的前半段在 amp 3'-end 之後的原 vector 上，後半段在 xxx
05/01 17:26, 11F
→
05/01 17:28, , 12F
抗生素的 3'-end 上，當然要比一般 primer 要長一點。然後拿
05/01 17:28, 12F
→
05/01 17:29, , 13F
去 PCR amplify。最後3種 plasmid 的大小應該有差，切膠分離
05/01 17:29, 13F
→
05/01 17:31, , 14F
要不然拿 DpnI 處理過是最好。
05/01 17:31, 14F
→
05/01 17:32, , 15F
最後再拿去 transform 量產和定序。
05/01 17:32, 15F
→
05/01 17:34, , 16F
咦，不對，這樣會有四種 plasmid 。把 xxx vector 先用RE切
05/01 17:34, 16F
→
05/01 17:35, , 17F
到包含 xxx 抗生素 DNA 的最小片段，分離純化，再和含 amp
05/01 17:35, 17F
→
05/01 17:35, , 18F
的 vector 放在一起進行 PCR 量產。
05/01 17:35, 18F
→
05/01 18:36, , 19F
我用過上面的方法塞入最長1.5k,同時踢掉幾10bp,不過是先放
05/01 18:36, 19F
→
05/01 18:41, , 20F
大xxx後先純化,再以此當primer以site direct去換amp vectr
05/01 18:41, 20F
→
05/01 22:31, , 21F
我自己没塞過東西，而是用類似的方法進行同一段 DNA 上不同
05/01 22:31, 21F
→
05/01 22:34, , 22F
片段的置換，所以想說以前的方法，原 PO 可以考慮。blence
05/01 22:34, 22F
→
05/01 22:36, , 23F
的方法更簡單，但我們兩者的 primer 設計應該是一樣的。
05/01 22:36, 23F
→
05/01 22:40, , 24F
而 blence 的方法應該會能省 primer 的設計長度。
05/01 22:40, 24F
推
05/02 03:14, , 25F
感覺買新plasmid會比同源互換較多錢XD
05/02 03:14, 25F
→
05/02 03:14, , 26F
*省
05/02 03:14, 26F
推
05/02 11:03, , 27F
可以先上addgene找看看有沒有適合的
05/02 11:03, 27F
推
05/06 22:01, , 28F
可以試試看PIPE cloning 可以做deletion,insertion
05/06 22:01, 28F
→
05/06 22:03, , 29F
放新的基因要4條引子，deletion,insertion兩條就夠了
05/06 22:03, 29F
→
05/06 22:05, , 30F
兩條引子P完用dpnI背景切乾淨直接電穿孔，只是變沒抗性
05/06 22:05, 30F
→
05/06 22:05, , 31F
colony PCR要多篩一點
05/06 22:05, 31F
→
05/06 22:06, , 32F
Ice9大大說的感覺是RF-cloning
05/06 22:06, 32F
‣ 更多 babylikeg 的文章
文章代碼(AID): #1LGlBi75 (Biotech)