[求救] Real-time PCR的Ct值和螢光強度

看板Biotech作者 (Caramel Waffle)時間9年前 (2015/04/29 15:38), 9年前編輯推噓8(8推 0噓 17→)
留言25則, 8人參與, 最新討論串1/1
各位前輩們好 最近我用cDNA做real-time PCR 但手邊兩組設計位置相差不遠的primers及probes (組A, 組B) 實驗結果(一次只加一組) Ct值十分接近 但45個cycles後 螢光值卻差了兩倍 (A組是B組兩倍) 雖說定量只會用到ct值 但我實在不知道哪一組比較適合 且也不知道為什麼會發生這種事QQ 我還設計了C組primers/probes 在同基因但離較遠的地方 其實驗結果Ct值和螢光都與A組較接近 希望前輩們幫忙解惑 感激不盡! 不知道A組或B組誰較適合 或都可以 >< 若需要補上什麼細節也請告訴我 謝謝(*?>д<) -- Sent from my Android -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 42.78.252.120 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1430293102.A.5C7.html ※ 編輯: simoncharlie (42.78.252.120), 04/29/2015 15:54:35
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45 cycles後的東西準嗎奇??
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melting curve呢??
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現在的機器應該會autobaseline吧??且太多cycle也不行.
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沒記錯，大於33個cycle後比較沒意義了
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沒有做melting curve @@ 兩組都是隨cycles數 螢光值有著漂亮的s型(倒)上升曲線 但一個s比較高 一個比較低 但沒注意33cycles以前是不是profile一樣@@ 晚點來看看 :) ※ 編輯: simoncharlie (42.70.80.232), 04/29/2015 17:24:34
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附個圖吧!! 基本上45cycle後的東西不用管了啦
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測試primer melting curve 一定要做
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不然不知道primer專一性如何
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沒注意，你是用taqman system的話就還好@@
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推
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所以可能只是A,B組primer在PCR效率上的差異囉?
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推
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probe不用melting啦 可是45cycle的話quencher應該也掉了XD
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真不不要在意 45 cycles 之後的事情了。就連 35 cycles 前若
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是 curve 不美，我都要抓頭了。
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圖來了! 怎麼辦 好像長得不太一樣QQ! http://ppt.cc/7cgH 三重複 所以有九條線 比較高的六條 就是A和C組primers/probes 的結果 比較低的三條就是B組 用來算Ct值得那條橫線(baseline threshold) 是軟體拉的 九條線都落在 15 +- 0.25 @@ ※ 編輯: simoncharlie (118.160.113.18), 04/29/2015 21:39:44
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很漂亮的圖啊。你只要看 30 甚至是 20 cycles 之前的就可以
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我還覺得，就 primers 而言，B組在 16 cycles 前就比A或C其
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中之一還『敏感』。我大概會選B組來做。
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請問怎麼看得出"敏感"呢?!
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plateau的螢光值跟你的amplicon size有關
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多少莫耳數 最多就只能轉出多少產物
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^primer 是限制試劑
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同莫耳數 片段大的螢光比較強
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以上對sybr的qPCR來說
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taqman probe 的 我覺得變異更大
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-.,- 沒差
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原po這個 其實跟probe效率比較有關 而且跟螢光組合也有關
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係 更甚者 如樓上大大說的 primer夾的效率也有關係
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