[求救] TRIZOL 抽 RNA的pellet形狀
想請教大家幾個關於用TRIZOL抽RNA的問題..
步驟大致上都是照著說明書上的進行
收集sample時 TRIZOL加 750 ul
chloroform 加 200 ul後 搖晃混濁靜置 3-5 分鐘後離心
接著抽取水層上清液 水層大概是有 400 ul
我只取了 100 ul或200 ul 加入400ul的isopropanol，搖晃混濁靜置10mins後離心
第一個問題是
在離心後會出現RNA pellet 說明書上寫的是"gel-like"pellet
而我出現了兩種
只取100ul的是gel-like半透明的pellet
而取200的白色羽毛狀(一條線)的pellet
接著都進入後續步驟
在最後用nanodrop定量時
gel-like的濃度在60ug/ul左右，260/280在1.8-2之間，但是260/230則只有1以下
羽毛狀的則濃度在100ug/ul左右，260/280在 1.5-1.6之間，260/230在2左右或是1.5-1.6之間
搜尋了網路上的討論，造成此差異的原因好像是isopropanol的量不同造成樣子pellet不同。
想請問大家..
1.正確的pellet是什麼形狀才對呢 ?
2.一般來說260/280太低是蛋白汙染，但是我很確定我沒有抽到最下粉紅色層的(很注意盯著看Q口Q)為什麼還是會污染呢?
3.260/230低是鹽類汙染，會用75%EtOH wash來改善，想請問大家wash pellet的方式是?會vortex嗎?
4.說明書上的cholorform建議是和TRIZOL 5:1 請問可以增加嗎?會增加水層的量嗎?
5.如果想將已經回溶在DEPC水裡的RNA在沉澱有建議的方法嗎?
問題很多 麻煩大家了 ! 謝謝 ~~
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