[求救] PCR product 定序

看板Biotech作者 (欣承男孩)時間9年前 (2015/04/13 16:22), 編輯推噓3(3推 0噓 12→)
留言15則, 9人參與, 最新討論串1/1
各位版友大大好 最近小弟在做PCR定序的實驗 想檢驗我PCR的產物是否如自己預期想P出來的片段 PCR產物的片段約200bp 做法是PCR之後跑膠 然後從膠中萃取並純化DNA 根據跑膠的結果發現位置如自己預期是在200bp的位置 從膠中萃取PCR產物後的DNA總量約900ng 濃度30ng/ul A260/280在1.8左右 然後送到學校的共儀去做定序 送定序的DNA sample我取總量15ng配成總體積5ul 再外加1ul的primer(6uM) 定序的Primer我是直接用PCR Forward的Primer 最後出來的結果 一開始定的序列既不正確也很奇怪(就是一堆亂碼...) 大概是到了第30~40個bp後定出來的序列才跟我的預期是一致 簡單來說就是前面30~40個bp序列是不對的(參雜亂碼) 之後的序列就都跟預期的一致 我想問說就是這樣的情形可以說是我PCR定序的結果是成功的嗎 根據實驗室學長的說法好像定序一開始出來的序列的不太可信 還是說我要用Reverse的primer來定反股來做一個雙重的驗證??? 想請教各位有經驗的大大們了~~~感謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.121.119 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1428913379.A.303.html
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04/13 17:00, , 1F
是看ab1檔還是txt檔？
04/13 17:00, 1F
推
04/13 17:09, , 2F
定序請設計另一條引子 以pcr引子定前幾個字會不準 一
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04/13 17:09, , 3F
般定序公司會有說明
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04/13 17:32, , 4F
兩種檔都有看 不過兩種檔的結果不是都一樣嗎???
04/13 17:32, 4F
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04/13 17:54, , 5F
ab1其實可以人工判讀看出seq是不是真的有異
04/13 17:54, 5F
推
04/13 18:12, , 6F
好一點還可以看heterozygote XD~
04/13 18:12, 6F
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04/13 18:28, , 7F
本來就會這樣 前50個mer訊號都會亂七八糟
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04/13 18:28, , 8F
想看前面大概都會送進sequencing vector裡面
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04/13 18:54, , 9F
可反方向定回來即可知道最開頭序列
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04/13 19:58, , 10F
這是正常的，所以你需要再從另一端讀回來
04/13 19:58, 10F
推
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正常的 不然就做個TA clone即可
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這是正常的。primer 後大約 20~30 mer 訊號本來就會差。
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想知道完整序列，可以選 Ianthegood 或 roy047 的方法。
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04/13 23:15, , 14F
另外，看預列還是用波狀圖(ab1?)檔比較精確，文字只是輔助。
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04/13 23:16, , 15F
文字有時會出錯，你得回去看圖形檔判斷。
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