[求救] PCR product 定序
各位版友大大好
最近小弟在做PCR定序的實驗
想檢驗我PCR的產物是否如自己預期想P出來的片段
PCR產物的片段約200bp
做法是PCR之後跑膠 然後從膠中萃取並純化DNA
根據跑膠的結果發現位置如自己預期是在200bp的位置
從膠中萃取PCR產物後的DNA總量約900ng 濃度30ng/ul A260/280在1.8左右
然後送到學校的共儀去做定序
送定序的DNA sample我取總量15ng配成總體積5ul 再外加1ul的primer(6uM)
定序的Primer我是直接用PCR Forward的Primer
最後出來的結果 一開始定的序列既不正確也很奇怪(就是一堆亂碼...)
大概是到了第30~40個bp後定出來的序列才跟我的預期是一致
簡單來說就是前面30~40個bp序列是不對的(參雜亂碼)
之後的序列就都跟預期的一致
我想問說就是這樣的情形可以說是我PCR定序的結果是成功的嗎
根據實驗室學長的說法好像定序一開始出來的序列的不太可信
還是說我要用Reverse的primer來定反股來做一個雙重的驗證???
想請教各位有經驗的大大們了~~~感謝
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