[求救] 合成兩條單股DNA再Annealing

看板Biotech作者 (Dusha)時間9年前 (2014/09/17 17:53), 9年前編輯推噓4(4推 0噓 7→)
留言11則, 8人參與, 最新討論串1/1
最近需要在construct中加入一段短序列 此序列前後加上RE切位後約有五十幾bp長 由於從國外訂plasmid較為昂貴 計算過後 想到 也許可以 合成兩股互補的很長的單股primer 再自行anneal起來便成一段雙股DNA RE切完塞到我要的vector 應該是比較方便和便宜的方法 想請問版上有沒有人曾經這樣做過的? 成功率高嗎? 有沒有什麼實驗細節需要注意呢? 謝謝~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.114.96.229 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1410947580.A.0CD.html
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09/17 18:36, , 1F
primer應該可以設計成annealing後直接有overhang, 不用RE
09/17 18:36, 1F
喔喔! 感謝你~ ※ 編輯: Dusha (140.114.96.229), 09/17/2014 18:59:55
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09/17 20:50, , 2F
做過啊 還做過再長一點用三段oligo來做pcr的XD
09/17 20:50, 2F
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09/17 20:59, , 3F
成功率非常高,之前都是用這方法做shRNA cloning
09/17 20:59, 3F
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09/17 21:00, , 4F
中研院RNAi core有protocol可以參考
09/17 21:00, 4F
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09/17 23:19, , 5F
短片段序列都這樣接,除了overhang,5'端加磷酸修飾比較好
09/17 23:19, 5F
推
09/17 23:25, , 6F
5'phosphorylation & annealing of oligos
09/17 23:25, 6F
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09/17 23:26, , 7F
方法大同小異 http://ppt.cc/ZWbX
09/17 23:26, 7F
推
09/17 23:33, , 8F
互補的就直接慢慢降溫就好了 很簡單
09/17 23:33, 8F
推
09/18 08:47, , 9F
做過用兩條反相primer直接塞66個bp的片段，一次pcr就
09/18 08:47, 9F
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09/18 08:48, , 10F
進去了
09/18 08:48, 10F
好的 謝謝各位! ※ 編輯: Dusha (140.114.96.229), 09/18/2014 12:28:28
推
10/01 19:36, , 11F
放沸水內10分鐘，然後整盆水連同你的dna移至室溫慢慢降溫
10/01 19:36, 11F
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