[求救] PCR跑不出來!! 請各位前輩幫忙..

看板Biotech作者 (sharkhsu)時間10年前 (2014/09/11 16:28), 10年前編輯推噓5(5推 0噓 16→)
留言21則, 10人參與, 最新討論串1/1
既上次抽染色體的問題解決之後，現在又遇到PCR的問題。 之前抽出的E.coli K12 測nanodrop濃度約:350ng/μL 260/280:2.04 ； 260/230: 1.88 配方如下: 10x buffer:10μL dNTP:10μL primer(50μM):各1μL KOD:2μL MgSO4:6μL template:3μL DI水:67μL PCR condition: 95度C 120sec --->denature 55~65度C 60sec---> annealing 72度C 60 sec ---->extension 30 cycle 配成100μL分成10管測溫度gradient，但每次跑膠完幾乎都沒東西。 和老師討論完的結果，可能是template的量太多。於是又改成1μL去跑， 但跑出來也是全部空的..所以想請問各位前輩問題可能出在哪裡!? 去查DNA template的使用濃度說法也都不同.. 現在也滿擔心本身template或primer本身出問題.. -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.123.126.146 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1410424123.A.CBB.html ※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/11/2014 16:29:29 ※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/11/2014 16:40:47 ※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/11/2014 16:45:21
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09/11 16:50, , 1F
dNTP濃度多少?之前發生過有人忘記dilute所以跑不出來
09/11 16:50, 1F
dNTP:2mM
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09/11 18:09, , 2F
既然用了KOD，為什麼PCR condition不是照KOD的建議？
09/11 18:09, 2F
呃..實驗室學長也是用差不多的條件，所以就沒再調整了
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09/11 20:59, , 3F
template濃度是um還是nm？
09/11 20:59, 3F
當時測出來的時候是350 ng/uL .. ※ 編輯: shunminhsu (114.35.165.133), 09/11/2014 22:18:11 ※ 編輯: shunminhsu (114.33.254.137), 09/11/2014 22:21:02
推
09/11 22:32, , 4F
建議你用KOD建議的條件做~太濃的template KOD反而沒產物
09/11 22:32, 4F
推
09/12 10:07, , 5F
同樓上 原ＰＯ真的太濃了
09/12 10:07, 5F
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09/12 10:24, , 6F
template用10%
09/12 10:24, 6F
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09/12 10:25, , 7F
然後為什麼不把條件列成濃度還要我們幫你算= =
09/12 10:25, 7F
因為我不太懂濃度的單位... 去參考每個人的都不同= = ※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/12/2014 10:37:39
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09/12 10:45, , 8F
各種PCR條件的濃度單位幾乎都一樣,只有數值的不同
09/12 10:45, 8F
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09/12 10:4, , 9F
如果各家都不同,何不直接參照KOD就好,整篇都沒寫單位很扯
09/12 10:4, 9F
不好意思，這部分我會再注意.. [1;31m→ supray: 單位要弄清楚呀... 09/12 11:49 supray: amplicon多大呢? 09/12 12:33 要P的產物大概950bp，照理不難P才對 冏 ※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/12/2014 13:41:50
推
09/12 13:42, , 10F
KOD建議plasmid的template濃度只要1ng就好~你下了多少？
09/12 13:42, 10F
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09/12 13:43, , 11F
genomicDNA只要200ng就好
09/12 13:43, 11F
呃... 最後一次dna template是加1μL .. 溶液總量100μL ※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/12/2014 14:09:16 ※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/12/2014 14:10:10 ※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/12/2014 14:17:03
推
09/12 15:43, , 12F
只能建議盡量用"重量"或"濃度"去算 少用體積才不會失了
09/12 15:43, 12F
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09/12 15:43, , 13F
重點
09/12 15:43, 13F
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09/12 17:37, , 15F
是上面那組嗎?
09/12 17:37, 15F
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09/12 17:39, , 16F
說明都寫得很清楚 也有Troubleshooting呀
09/12 17:39, 16F
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09/14 17:11, , 17F
不管怎麼樣換成濃度都比體積好
09/14 17:11, 17F
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09/15 04:32, , 18F
volume is nothing!!
09/15 04:32, 18F
推
09/22 17:32, , 19F
我的經驗是這樣，使用多個濃度的DNA去做PCR,看哪個濃
09/22 17:32, 19F
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09/22 17:32, , 20F
度有做出來就使用那個濃度
09/22 17:32, 20F
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09/29 00:16, , 21F
1.建議重測濃度 2.起始denature溫度跟時間?
09/29 00:16, 21F
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