[求救] 關於SDS-PAGE

看板Biotech作者 (滿滿的希望!!)時間10年前 (2014/06/09 13:43), 10年前編輯推噓4(4推 0噓 29→)
留言33則, 9人參與, 最新討論串1/1
如題，最近實驗室跑SDS-PAGE出現重大的問題 附上圖片http://ppt.cc/nd-s http://ppt.cc/Y0yS 這個是跑完退染之後的照片，不知道為什麼在100kDa的附近會有一條不明條帶 通過該條條帶的band就會像圖片上所顯示變得歪七扭八 我們家使用的SDS-PAGE 上層膠5%，下層膠是10% 使用的電壓為100V、120min 機器上顯示的電流大約為20~40mA之間 也有試過定在15mA下去跑，狀況依舊 使用的PH值為6.8和8.8，藥品都是最近新鮮配製的， 不管是Tris-base(HCl調製到所選PH值)，還是電泳的buffer APS也是新鮮配製，TEMED是新分裝出來的，實驗室都放在4度C冰箱保存 Acrylamide我家使用的好像比較特別，是30%的那一種 不過也跟別人家的實驗室借過40%的來使用，情況還是一樣 sample buffer也是最近才配置，含有2-ME的那種版本 我已經抓問題抓到不知道還有甚麼東西出問題會造成這樣的現象! 上圖都是使用的ATTO的系統所跑出來的膠圖 附上使用Bio-Rad跑的膠圖 http://ppt.cc/3BP4 使用的蛋白來源是組織經由超音波震盪萃取出來 濃度大約為30ug左右吧(沒有經過確實定量因為是測試所以就隨意抓一下! 這現象最近一個月才出現，完全不知道是為什麼? 想請問版上的各位，有人遇過和我一樣的情況嗎?有甚麼解決辦法! 還是有甚麼東西是我沒有注意到的，謝謝大家! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.130.98.85 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1402292635.A.491.html ※ 編輯: lidon00968 (140.130.98.85), 06/09/2014 13:51:15
推
06/09 15:20, , 1F
推測是配下膠時沒壓好
06/09 15:20, 1F
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06/09 15:22, , 2F
不然就是stacking時用更小的電壓去跑,用60~80V
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06/09 15:44, , 3F
將pH6.8的buffer，通過0.22um過濾後再使用。
06/09 15:44, 3F
關於過濾一點，我會立刻嘗試看看，非常感謝! 補上綠色箭頭以上代表就是上層膠體的部分，這幾次我都有特地保留上層膠染色 http://ppt.cc/8sto 做下層膠做完的時候我都是用70%酒精下去壓 倒掉酒精的時候可以看出下層膠很平，也看不到那條詭異的線 但是跑完膠之後其實隱約就可以到到那條怪怪的東西跑出來，染完色更明顯就是! ※ 編輯: lidon00968 (140.130.98.85), 06/09/2014 16:02:00
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06/09 17:15, , 4F
在marker那條,第1,2次有出現,第3次沒有,是補PSB的差異？
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06/09 17:47, , 5F
請問PSB是甚麼東西? 是系統不同 分別是ATTO和Bio-Rad
06/09 17:47, 5F
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06/09 17:48, , 6F
我家sample的處理都是樣品+水+sample buffer
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06/09 17:48, , 7F
不過蛋白萃取的方式是取0.5mg組織+500ul PBS進行超音波
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06/09 17:53, , 8F
樣品配好後會100度煮10分鐘 然後才進行跑膠
06/09 17:53, 8F
※ 編輯: lidon00968 (140.130.98.85), 06/09/2014 21:54:00
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06/09 23:36, , 9F
有個疑問pH6.8的buffer，通過0.22um過濾後pH值不會上升嗎?
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06/09 23:45, , 10F
好奇為什麼會上升? 理論是?? 今天我又再配製一次藥品
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06/09 23:45, , 11F
明天再來測試看看狀況是否有改善!
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06/10 00:04, , 12F
protein sample buffer;你的marker那條,只有第三次沒出現
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06/10 00:33, , 13F
請從PSB確認最後濃度至少有1X,以及8.8與6.8是從Tris base配
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起,至於6.8先過濾或調降電壓,除非你們只想先看到data,不然
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06/10 00:36, , 15F
這兩種不是一般實驗室操作必要的條件,顯然也不會是問題所在
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非常感謝，今天已經全部再重新配製所有會用到的藥品 從tris-8.8和6.8、sample buffer、running buffer都重新配置 6.8和8.8也都有作過濾的動作，明天會再試試看是否有改善 再次謝謝大家! ※ 編輯: lidon00968 (36.237.212.42), 06/10/2014 01:00:29
推
06/10 11:53, , 16F
感覺是下膠還沒完全凝固就加上膠
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06/10 19:09, , 17F
我很確定我下膠凝固後，才吸掉酒精，確定是平的
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才加入上層膠溶液做上層膠
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推
06/10 20:16, , 19F
感覺是下膠濃度不均勻，前兩張圖都有一半的lane跑得頗歪
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做膠時混勻後再加，另外也有可能是機器老舊而電流過高
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06/10 20:18, , 21F
試著條低電壓跑或在低溫跑看看
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06/10 20:49, , 22F
了解，非常感謝!! 如果要換機器，老闆可能會崩潰XD
06/10 20:49, 22F
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06/11 06:03, , 23F
你有沒有重配10% SDS?
06/11 06:03, 23F
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06/11 06:05, , 24F
或是RUNNING BUFFER的SDS濃度太低 之前實驗室發生過類似情況
06/11 06:05, 24F
禮拜一重新配製藥品後，總算恢復正常! 非常感謝版友們的協助!! 推測應該是那罐快10年SDS壞了，所有會使用到SDS的溶液全部都使用新的SDS配製 現在都很正常! 附上一張現在的膠圖 http://ppt.cc/2A-2 非常感謝大家! ※ 編輯: lidon00968 (140.130.98.85), 06/11/2014 13:14:14
推
06/12 15:31, , 25F
哇，SDS會壞喔，這真的沒遇過。
06/12 15:31, 25F
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06/12 15:31, , 26F
上了一課。
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06/13 22:09, , 27F
而且是在第十年才壞，前9年還是好的？
06/13 22:09, 27F
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06/19 16:22, , 28F
不知道.. 東西全部都測試過了 直到換了SDS才好
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08/02 02:54, , 29F
我在不同實驗室遇過兩次這種怪膠 都是RUNNING BUFFER出事
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08/02 02:55, , 30F
一次是有配RUNNING BUFFER STOCK沒加10% SDS
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08/02 02:56, , 31F
然後對稀釋完的RUNNING BUFFER補對應的10%SDS就OK
08/02 02:56, 31F
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08/02 02:57, , 32F
第二次是有人稀釋STOCK手殘忘了加STOCK 我要求重配也沒人信
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08/02 02:58, , 33F
然後有問題的RUNNING BUFFER一用完 稀釋新的一瓶就回復正常
08/02 02:58, 33F
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