[求救] phalloidin staining

看板Biotech作者 (gugu283)時間10年前 (2014/04/26 00:30), 編輯推噓5(5推 0噓 28→)
留言33則, 8人參與, 最新討論串1/1
請問有關phalloidin的螢光染色實驗~ 我想觀察F-actin的polymerization 使用Acti-stain 488的phalloidin 細胞為MDA-MB-231 製作sample過程如下: 3.7%formaldehyde fix 10 min warm PBS wash 0.5% triton 5min PBS wash 100 nM phalloidin 30min PBS wash X3 100 nM DAPI 1min wash seal 但是在螢光顯微鏡下觀察 細胞形狀都爛爛的 很多毛邊 甚至呈萎縮狀 沒辦法看到一束一束的F-actin 而是整顆細胞都綠色的 而且細胞內感覺染到很多顆粒 請問有什麼方法可以改善細胞形狀的問題? 整顆細胞的綠色是可能為non-specific binding嗎? (我已試過phalloidin內加1% BSA，或染之前先以1% BSA bloking 30min ) 感激不盡!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 111.240.36.217 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1398443415.A.4B6.html
→
04/26 00:40, , 1F
FA也要warm!!! or try methanol fix
04/26 00:40, 1F
推
04/26 11:14, , 2F
triton X-100 只要0.1%就夠了 & DAPI看起來如何？有可能不是
04/26 11:14, 2F
→
04/26 11:14, , 3F
染色過程出問題，而是細胞本身狀態就不好
04/26 11:14, 3F
→
04/26 13:11, , 4F
DAPI染起來OK, 我會試試看warm FA, 但是methanol似乎會破
04/26 13:11, 4F
→
04/26 13:13, , 5F
壞actin?那我triton 也改成0.1%試試看；細胞本身是還好雖
04/26 13:13, 5F
→
04/26 13:14, , 6F
然沒有很漂亮 但我固定完跟triton處理完在顯微鏡看 都沒有
04/26 13:14, 6F
→
04/26 13:15, , 7F
像染完以後萎縮得那麼厲害 毛邊也沒有那麼多@@
04/26 13:15, 7F
→
04/26 15:15, , 8F
我用90%甘油封片會有影響嗎?
04/26 15:15, 8F
→
04/27 20:59, , 9F
如果DAPI沒問題~應該就是DAPI以前步驟的關係
04/27 20:59, 9F
推
04/28 06:59, , 10F
不要亂教.. phalloidin 不會認 methanol fixed actin fiber
04/28 06:59, 10F
→
04/28 07:00, , 11F
PFA or FA 溫的冷的都沒差
04/28 07:00, 11F
→
04/28 19:22, , 12F
請問有人有經驗應該cold去固定還是warm固定比較好呢?
04/28 19:22, 12F
→
04/30 11:34, , 13F
請問有人用過這隻phalloidin嗎?不知道有沒有人試過濃度?
04/30 11:34, 13F
→
04/30 11:36, , 14F
我有試過更高濃度但還是整顆細胞都綠色，看不太到fiber
04/30 11:36, 14F
→
04/30 11:38, , 15F
我也試過染時放37度C 但還是整棵綠 小妹都要崩潰了T^T
04/30 11:38, 15F
推
05/01 17:37, , 16F
哪隻pholloidin?? 我常用的是invitrogen的A12379
05/01 17:37, 16F
→
05/01 17:38, , 17F
跟你的步驟差不太多，只是pholloidin染色時放37度C
05/01 17:38, 17F
→
05/01 17:38, , 18F
然後依照細胞不同調整所需pholloidin的量，選一個最好的
05/01 17:38, 18F
→
05/01 17:40, , 19F
我是用warm&fresh prepared 4 %PFA。Triton 則是用0.1%
05/01 17:40, 19F
→
05/01 17:41, , 20F
之前我用0.5%的trixton時也印象中是整顆綠，沒有fiber
05/01 17:41, 20F
推
05/01 18:21, , 21F
會是PBS/PBS"T"的問題嗎? tween20可以維持triton開的孔洞
05/01 18:21, 21F
→
05/02 12:48, , 22F
不知道跟cell type有沒有關係~有沒有其他細胞可以當con
05/02 12:48, 22F
→
05/02 12:48, , 23F
tol呢
05/02 12:48, 23F
→
05/03 21:22, , 24F
我調整了之後還是染不太到fiber欸...而且細胞形狀一直很爛
05/03 21:22, 24F
→
05/03 22:11, , 25F
FA和PFA固定有差嗎?還是不是專門用來培養細胞的玻片會有差
05/03 22:11, 25F
→
05/03 22:11, , 26F
我是沒有看過有人用PBST耶@@
05/03 22:11, 26F
→
05/03 22:12, , 27F
我用的是cytoskeleton的Acti-stain 488 拜託高手解救T^T
05/03 22:12, 27F
→
05/04 01:13, , 28F
data sheet用的細胞是3T3，看看是否要拿來當control
05/04 01:13, 28F
→
05/04 01:14, , 29F
或者我本身經驗是WI-38以及A549都可以非常容易染到Fiber
05/04 01:14, 29F
→
05/04 01:14, , 30F
找些positive control確認你的所有材料都沒問題吧!!
05/04 01:14, 30F
推
05/25 13:11, , 31F
我們全都在室溫下
05/25 13:11, 31F
→
07/21 16:03, , 32F
你的phalloidin接的是綠色螢光，細胞當然是綠色的....
07/21 16:03, 32F
→
07/21 16:05, , 33F
降低phalloidin的濃度或wash久一點，應該會出現你要的。
07/21 16:05, 33F
‣ 更多 gugu283 的文章
文章代碼(AID): #1JMesNIs (Biotech)