[求救] Western blot的protein似乎卡在well
目前正在用SDS-PAGE嘗試壓185kD左右的蛋白質,
試過很多次,但每一次的結果都是在250kD以上有很淡且形狀不規則的band,
而且可以另外看到很深色的band緊鄰於well下方。淡band離深色band有一段距離。
然而其他比較小的protein(140以下)情況正常。
抗體的專一性、marker的正確性應該是沒問題,
所以這樣的情況我懷疑是protein aggregate,或是有multiprotein complex卡在gel下
不去,我查到網路上有些人建議不要煮,會使protein aggregate,但是有人卻說煮也
沒關係;有人是說煮完要再離心一次,只取上清(但是這樣濃度不就變了@@);有人建
議用DTT;總之,眾說紛紜……
不知道各位知不知道什麼方法可以改善這種情況?
謝謝。
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Protocol如下:
1. 1XRIPA(含proteinase inhibitor)萃取protein:組織搗碎之後sonicate(也試過
不sonicate),4度C離心15min,取上清液,測濃度,加入1XRIPA與sample bfr(含
2-ME)配好每一管sample(80-100ug/well)
2. 100度C水煮5min,on ice 2min
3. load in 7%(也試過8%)的gel,60V 30min,然後轉90V 1hr30min
4. Transfer(濕式) 75V 4hr到PVDF membrane上
5. Blocking 2hr in 5% TBST-milk 室溫
6. 1Ab 1:1000 overnight 4度C
7. TBST wash 10min X3
8. 2Ab 1:1000 1hr 室溫
9. TBST wash 5min X4
10. TBS wash 5min X2
11. ECL呈色
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那你是用DTT?
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已經跑到gel的邊緣了
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是
※ 編輯: lacampanella (61.230.126.111), 03/31/2014 08:04:32
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