[求救] q-PCR每一批control的GAPDH量不一樣

看板Biotech作者 (戰鬥小雞)時間10年前 (2014/03/28 22:28), 編輯推噓5(5推 0噓 16→)
留言21則, 5人參與, 最新討論串1/1
各位大大好 我q-PCR跑出來的GAPDH每一批sample的contrl組所測出來的值都不一樣(ex:28,18,31) 但是實驗室的人卻沒有這種問題, 他們說每一批的control組測的值都差不多。 有想過可能是轉cDNA的過程出錯,但是我一次都是轉很多批, 所以那次轉的那幾批應該也要差不多才對,可是卻沒有。 定量的機器是Maestrogen nano drop, PCR機器是ROCHE的light cycle 480。 請問有可能是那些地方會影響到GAPDH的差別? 感謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 61.219.58.112 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1396016888.A.680.html
推
03/28 22:52, , 1F
1. 只用GAPDH當internal control不一定足夠,有時
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03/28 22:53, , 2F
GAPDH表現量仍可被影響,建議再找1個2個其他genes輔助
03/28 22:53, 2F
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2. 照你寫的Ct值(28, 31)似乎遠低我印象中GAPDH的ct值
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03/28 22:55, , 4F
不知道你拿多少RNA轉cDNA,又拿多少template跑qPCR
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你似乎要確定你RT有轉成功
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3. nano drop也只是用OD260來測量RNA conc.相對準但
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不是絕對,不知道你的260/280還有260/230值多少?
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推
03/28 22:59, , 8F
cybr green有混均勻嗎?(認真)
03/28 22:59, 8F
推
03/28 23:01, , 9F
至於其他操作問題,我就不提了,請其他高手補充
03/28 23:01, 9F
推
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加一個PTC calibator... 作△△CT 讓沒次跑的數據跟PTC比Ra
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tio, 這樣就算ref有變動也不會影響實驗數據. 用LC480的話
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直接派就行了
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記得Calibator最後會設為0..用advance relative 改linear
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顯示 我想你的數據就ok了
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03/29 13:44, , 15F
多加1-2house keeping gene+1
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推
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RNA quality 除了看260280值也可以跑一下膠check
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感謝各位指導,internal control會再找找看其他的,因為有關
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細胞體積,所以才沒用actin等。cybr green是有mix均勻的,因
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為我每次跑的同一批GAPDH都會一樣,所以我猜測是轉cDNA時的
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問題。j大的方法我會再研究一下,感謝唷!
03/29 17:02, 20F
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感謝a大的建議
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