[求救] 切位是正確的但是切不下來

看板Biotech作者 (藍雪)時間10年前 (2014/03/27 11:24), 編輯推噓1(1推 0噓 4→)
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我設計基因左右兩邊不同的切位(XbaI/KpnI)的primer(有多加4個mer) PCR之後加A,ligation到pGEMt-easy 之後抽plasmid送定序,序列是對的,切位都在 切EcoRI OK 跑基因全長的PCR OK 跑M13F+M13R OK 唯獨切XbaI和KpnI切不下來... XbaI和KpnI確定沒有問題 我用同樣的條件切另一個clone的基因是可以切下來的 我是先切XbaI 1HR 再切 KpnI-HF 30 mins (NEB) 想請問有沒有什麼問題是我沒有考慮到的? 謝謝~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.117.93.237 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1395890649.A.F0D.html
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03/27 11:54, , 1F
methylation? CpG? 還是你要切久(O/N)看看?
03/27 11:54, 1F
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03/27 11:55, , 2F
XbaI 是dam methylation sensitive
03/27 11:55, 2F
謝謝提點 我的切位序列是 5' 3' GAT|CTAGACC CTAGATC|TGG 3' 5' 網路上找到的資料是 XbaI前後有GATC就會受甲基化影響 請問甲基化的問題有辦法解決嗎? 或是換限制性切位會比較快? 謝謝 ※ 編輯: bluesnow1122 來自: 140.117.93.237 (03/27 12:37)
推
03/27 12:51, , 3F
找dam-的菌株(ex. JM110) 或是設計別的切位都可
03/27 12:51, 3F
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03/27 13:41, , 4F
謝謝^^
03/27 13:41, 4F
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03/27 13:41, , 5F
樓上正解~ 沒dam就不會甲基化了 plasmid seq不受影響
03/27 13:41, 5F
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