[求救] 小片段蛋白表現

看板Biotech作者時間10年前 (2014/02/11 12:14), 編輯推噓4(4推 0噓 16→)
留言20則, 10人參與, 最新討論串1/1
大家好~ 小妹在實驗上遇到一點困難，想請問一下大家>< 目前因為實驗上的需求想純化小片段的蛋白 首先將蛋白依domain切成四個部分construct到pET-22b(+) Vector 定序結果都ok 但是利用BL21-CodonPlus Competent Cell表現的結果 只有一段可以表現在上清液，其他三段則是都不表現 目前試過的條件有25度及37度 IPTG的濃度試過0.5mM及1mM 由於是第一次純化，也不是很確定可以再修改那些條件 想請問大家是否有其他的建議 感激不盡!!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.121.239
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02/11 12:31, , 1F
這樣猜是有點蠢...是只有前面第一段會表現,後三段都不表現?
02/11 12:31, 1F
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02/11 12:38, , 2F
不是耶 是只有第二段表現@@
02/11 12:38, 2F
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02/11 14:59, , 3F
所以是4個construct四組菌的意思?
02/11 14:59, 3F
推
02/11 15:34, , 4F
先從whole cel lysate看看有沒有你要的分子量
02/11 15:34, 4F
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02/11 15:35, , 5F
另外要不要找找inclution body的可能性？
02/11 15:35, 5F
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02/11 16:33, , 6F
I大~ 沒錯!是有四組菌~~~
02/11 16:33, 6F
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02/11 16:34, , 7F
H大~有壓片看過tag，分子量接近的地方都沒有band ><
02/11 16:34, 7F
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02/11 17:12, , 8F
挑其他clone試試看
02/11 17:12, 8F
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02/11 17:23, , 9F
真的表現不出來的話 只能換vector 試試pET系列的tags
02/11 17:23, 9F
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02/11 17:30, , 10F
可以試試抓不同表現時間看看
02/11 17:30, 10F
推
02/11 23:31, , 11F
請問induction時間以及分子量?
02/11 23:31, 11F
推
02/12 09:25, , 12F
我建議妳換換vector@@
02/12 09:25, 12F
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02/12 10:49, , 13F
分子量大約20KD左右，induction時間有試過4小時及18小時
02/12 10:49, 13F
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02/12 10:51, , 14F
C大~請問一下這個vector不好用嗎？因為有一段ok所以也沒想
02/12 10:51, 14F
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02/12 10:51, , 15F
過vector可能有問題XD
02/12 10:51, 15F
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02/12 11:59, , 16F
RNA有沒有表現?
02/12 11:59, 16F
推
02/13 23:34, , 17F
換個vector或是溫度可以低到15度 IPTG 也可以試看看0.1~0
02/13 23:34, 17F
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02/13 23:35, , 18F
.3mM 或是你有試看看純化看看會不會有呢?
02/13 23:35, 18F
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02/13 23:36, , 19F
frame有沒有對?
02/13 23:36, 19F
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02/14 18:03, , 20F
Frame是對的~我試了0.1mM IPTG等結果囉~感謝！！
02/14 18:03, 20F
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