[求救] 請問Real-time PCR相關問題

看板Biotech作者godinal (無心)時間12年前 (2013/12/18 23:30)推噓4(4推 0噓 7→)

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由於最近開始學習做Real Time PCR, 發生了很多問題...想詢問前輩們有何建議原本實驗計劃是將檢體分別測二個gene...P1及IC後相減計算deltaCt值做相對定量第一次做時就發生internal control primer之positive control看不到訊號所以同樣實驗再做一次...發現Ct值接近四十和實驗室前輩討論, 及troubleshouting後, 他覺得是tag enzyme(Roche)不穩定把enzyme由原本實驗條件0.3ul改為1ul後, internal control之Ct值就回歸28Ct 結果....就換成target gene P1出狀況原本annealing溫度設為64度，但某天突然連positive control都沒有signal... 結果...做PCR捉條件發現64度做不出來，annealing 溫度改為57度但在做Validation時發現57度連Negative control都出現訊號，而且Ct約30 後來帶我的前輩再重新捉條件將annealing 溫度改為60度但前輩用60度做出來negative control Ct值大都在40以後, 但我用同樣的條件Ct值都在30左右後來我們懷疑可能是我chemical污染，把所有的reagent都換新狀況還是沒有改善...有時Negative control有signal，有時positive control沒有signal 後來前輩懷疑水污染...所以決定換成One PCR...減少污染機率但我一直覺得很怪...為什麼實驗會這麼不穩定? 捉好的條件annealing溫度會這樣變來變去 Ct值差異性也很大...時有時無的... 前輩叫我腦力激盪看哪裡有問題? 但由於第一次接觸real time PCR...完全沒有概念所以想上來問問看有沒有前輩有經驗..可以給一點建議 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 42.73.198.254

推

KittyGod

12/18 23:42, , 1^F

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godinal

12/19 08:37, , 2^F

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godinal

12/19 08:38, , 3^F

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