[求救] PCR某些基因P不出來

看板Biotech作者 (Shivery)時間10年前 (2013/10/03 22:01), 編輯推噓9(9推 0噓 8→)
留言17則, 11人參與, 最新討論串1/1
各位好 小弟是第一次發文 小弟最近一直在碰PCR的實驗 我用 1% agar跑了5種基因的PCR(內染) 當中的GAPDH(ctrl組)亮度很OK 原先雖然4個基因都跑不出來 不過後來找到並試了學姊在畢業論文留下的annealing溫度後 IL-13跟MCP-1也有跑出來(雖然亮度沒GAPDH那麼強) 可是IL-4和TNF-a不管怎麼試都試不出來 想請各位想想應對或改進的方法 以下是我嘗試過的方法: 1.cDNA加倍 2.cycle數增加 目前最高用到35個cycle 3.primer照老師的說法我們家都是用過量，所以不改(但我有重配) 4.改annealing溫度 5.跑過RNA確定有東西 cDNA的OD值以及濃度也OK 最後有一個遇到的小小問題 原先我照primer送來時附的data sheet 裡面的Tm值-1度當做annealing溫度(畢業的學姊教我這麼做) 但P不出來 雖然後來用了學姊在畢業論文裡用的anealing溫度有些成 但溫度卻比我原先使用的高了6~7度 這是為什麼呢? 小弟只知道溫度低primer會容易黏 但也容易有雜訊 麻煩各位大大囉! ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章---- -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 36.238.181.192
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10/03 22:08, , 1F
借得到gradient PCR machine嗎?
10/03 22:08, 1F
推
10/03 22:11, , 2F
是P全長嘛? 只是P一小段 換另一對比較快
10/03 22:11, 2F
推
10/03 22:13, , 3F
訂好一點的primer
10/03 22:13, 3F
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10/03 22:14, , 4F
我可以借到gradient的機器 因為一開始我就是用那種的
10/03 22:14, 4F
第一次發文還不太會用請見諒...我原先是用gradient的機器跑 但後來教授跟我說用固定溫度的方式跑跑看(結果還是一樣) 此外primer我記得應該不是P全長 不過我只是個大學部學生... 不確定東西壞掉的前提下不太敢跟教授說我要訂這個訂那個... 以前教授跟我說過大學部的學生實驗做不出來 很容易第一個就懷疑reagent之類的東西而不是實驗者自己...^^" 加上我因為這問題data拖很久...(暑期計畫都變成trouble shooting...) 完全沒臉見教授啊啊啊((抓地 ※ 編輯: moon2040xyz 來自: 36.238.181.192 (10/03 22:23)
推
10/03 22:18, , 5F
不然就是去上real time PCR吧!比較靈敏
10/03 22:18, 5F
我沒試過那種測螢光的real time PCR... 會用的學長姊也畢業了... 我們家的實驗沒有大家都流通... 有些技術到我就斷了 畢業的學姊因為離開得很快我學不完~"~ 剩下的一位大學姊偏向做cancer所以測的基因也不一樣 共通技術只知道步驟都一樣 現在學新實驗沒人在旁邊指導我都會有點擔心... ※ 編輯: moon2040xyz 來自: 36.238.181.192 (10/03 22:29)
推
10/03 23:06, , 6F
你是拿infected sample還是mock sample?
10/03 23:06, 6F
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10/03 23:06, , 7F
不會的技術可以向附近實驗或者是同學打聽吧!
10/03 23:06, 7F
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10/03 23:06, , 8F
不然理論上前人也應該都會留下protocol
10/03 23:06, 8F
J大 不太好意思 我不太了解infected sample跟mock sample 是指什麼... S大 我會擔心是因為我曾經請學姊教我做ROS 然後學姊讓我follow她畢業論文上寫的步驟 可是我一直跑不出來 雖然和學姊再三確定過實驗條件 結果卻一樣 後來是請別間實驗室的人教我才成功 而如果有人在旁邊指導，我想一來可以給建議 二來我有做錯可以馬上糾正 而且...我們附近實驗室幾乎都是跟癌症有關 而我在研究偏過敏的實驗室... 如果是普遍的實驗技術應該還能跟別人參考 若是只有用在研究過敏的實驗可能就得參考期刊 ※ 編輯: moon2040xyz 來自: 36.238.181.192 (10/03 23:33)
推
10/03 23:44, , 9F
1%的 DMSO
10/03 23:44, 9F
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10/03 23:45, , 10F
primer設計越靠近3"端越好 如果RT是用oligodT的話
10/03 23:45, 10F
加入1%的DMSO嗎 這個我是沒有試過 不過我跑過的那些基因 學姊以前都有成功過 雖然大概過4個月了 不過都有很好的保存在-20 所以我想primer應該也沒問題 ※ 編輯: moon2040xyz 來自: 36.238.181.192 (10/04 00:04)
推
10/04 06:04, , 11F
那就先拿Positive control的來試條件
10/04 06:04, 11F
推
10/04 06:14, , 12F
還有你當初跑gradient設定溫度範圍內沒一管有產物嗎?
10/04 06:14, 12F
推
10/04 09:40, , 13F
primer如果是已經稀釋過的，拿stock重新稀釋，template是
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10/04 09:42, , 14F
哪種？DMSO通常用於genomic DNA強迫打開用，PCR簡單也很難
10/04 09:42, 14F
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剛剛看到是RT，有確認過RNA的品質了嗎？
10/04 09:43, 15F
我的產物不管是positive還是negative control都看不到IL-4和TNF-a的產物... 原先是follow學姊留下來的條件 但今天打算用gradient來找適合的溫度 而primer和template我都有重新配過了 結果還是一樣 抽的RNA O.D.也沒問題 用trizol抽的OD約在1.96~2.0之間 ※ 編輯: moon2040xyz 來自: 163.15.174.96 (10/04 10:35)
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10/07 02:19, , 16F
如果primer的序列為GC-rich 則加入final 1M的betaine 試試
10/07 02:19, 16F
推
10/16 06:29, , 17F
片段有多大？PCR反應程序？
10/16 06:29, 17F
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