[求救] ELISA做得很爛，老闆快抓狂 Q-Q

看板Biotech作者 (dusky)時間10年前 (2013/08/20 21:59), 編輯推噓6(6推 0噓 27→)
留言33則, 12人參與, 最新討論串1/1
餓死抬頭…… 接下這個任務也大半年了，但是做得依然很爛，也不知道是哪裡有問題 所以才上來請各位幫幫小妹我(跪) 我的實驗是用ELISA測定Plasma中的3-Nitrotyrosine濃度 先前情提要一下，我以前完全沒做過ELISA，在這部份我完全NEW 使用的KIT是CUSABIO的，使用的八爪是Eppendorf家的 原廠建議是用4-parameter去計算(我的愚婦腦袋只知道線性，對這玩意兒真的沒概念) 最低可偵測範圍是0.156 ng/ml 起初開始做的時候是duplicate的CV太大 但是我看了看data，我覺得是因為檢體的OD值都很低的關係，差一點點CV就爆20%了 雖然對結果的計算是沒差，因為duplicate的結果都是<0.156ng/ml 但老闆說「不行」!!!手法穩的話應該可以控制在20%以內 為了這20%我真的都快哭了…… 我加完檢體後就37度 incubation 2小時，完了之後接著就是把檢體直接甩掉拍乾 原廠說明書是寫不用wash 不知道是不是因為這個步驟的關係造成CV過大 所以後來我都先用八爪把大部份檢體吸出來後再拍乾 雖然有改善，但老闆還是覺得CV不該是這樣，應該要更小更漂亮才對 他覺得我是做分生的平常都1ul、2ul在加，現在給我加100ul應該沒問題 CV應該要更小 想請問大家在拍乾plate的時候有什麼訣竅嗎? 我都覺得每次拍的時候都會交互汙染的感覺 我看其他人都是直接倒扣，然後就開始啪啪啪狂拍 這樣真的不會交互汙染嗎???? 最近一次操作的問題是我的4套QC中有2套沒過，還跟Target value 差很多... 而這沒過的2套都是放在第3條well，我真的不知道是發生什麼事了… 但這次老闆似乎非常的生氣…… kit很貴，但我卻一直做不好 打到這心情又好down 先謝謝大家看完 因為現在手上沒有實驗的data，等明天到實驗室再補上來請大家幫我看一下 現在整個一團亂，很沒有頭緒的感覺也不知道是哪裡有問題 再次 感謝大家看完我的落落長廢話 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 1.171.165.235
→
08/20 22:32, , 1F
sample可以4度 overnight (其實我也是小嫩嫩)
08/20 22:32, 1F
推
08/20 22:53, , 2F
我也覺得4度 overnight做出來比較漂亮
08/20 22:53, 2F
→
08/20 22:53, , 3F
拍乾也是劈哩啪啦亂拍
08/20 22:53, 3F
→
08/20 23:36, , 4F
盡量垂直朝下 比較不會污染 拍乾底部墊衛生紙 拍過後再
08/20 23:36, 4F
→
08/20 23:37, , 5F
換另一面乾淨衛生紙部分去拍 應該不會污染 做這個 寧可
08/20 23:37, 5F
→
08/20 23:37, , 6F
多浪費點衛生紙 為求實驗精準
08/20 23:37, 6F
→
08/20 23:39, , 7F
有的人做就是固定定點的拍 但是我都怕污染別的well 所
08/20 23:39, 7F
→
08/20 23:39, , 8F
以會一直換紙
08/20 23:39, 8F
→
08/21 08:53, , 9F
盤子底面有乾淨嗎?
08/21 08:53, 9F
→
08/21 13:28, , 10F
是說我在讀OD值之前都會先把WELL底部擦一下欸~
08/21 13:28, 10F
→
08/21 16:07, , 11F
做VEGF這種簡單的不用4度就很漂亮了
08/21 16:07, 11F
→
08/21 23:32, , 12F
閱讀了幾家廠商的3-NT ELISA protocol，發現大多是在加sample
08/21 23:32, 12F
→
08/21 23:34, , 13F
的步驟就同時加入detection solution，您用的產品步驟是remove
08/21 23:34, 13F
→
08/21 23:35, , 14F
the liquid, don't wash.大概是3-NT不容易與capture Ab or
08/21 23:35, 14F
→
08/21 23:37, , 15F
something結合，所以使用remove一字而不寫aspirate，大概須小
08/21 23:37, 15F
→
08/21 23:40, , 16F
心移除liquid,不要再拍打吸乾，就進入下一步驟。
08/21 23:40, 16F
推
08/22 00:56, , 17F
有個問題想借此文發問 我的kit在wash的時候well內會有約
08/22 00:56, 17F
→
08/22 00:57, , 18F
300 ul的wash buffer 前陣子做也都是直接垂直朝下倒掉
08/22 00:57, 18F
→
08/22 00:58, , 19F
發現好像還是會有溢出的現象 因為盤子邊邊都濕濕
08/22 00:58, 19F
→
08/22 00:59, , 20F
後來有嘗試過先把wash buffer先用八抓吸掉再倒 就有改善
08/22 00:59, 20F
→
08/22 01:00, , 21F
只是這樣是每吸完一排 就要換一次tip嗎？不然還是會有
08/22 01:00, 21F
→
08/22 01:01, , 22F
交叉污染的現象？
08/22 01:01, 22F
推
08/22 09:04, , 23F
要注意八爪的TIP有沒有插緊 否則有些WELL會少加很多
08/22 09:04, 23F
推
08/23 12:17, , 24F
同一支八爪有人用過嗎? 會不會已經不準了
08/23 12:17, 24F
推
08/24 17:22, , 25F
真的會因此而交叉汙染嗎?我用R&D ELISA kit說明書裡講到wash
08/24 17:22, 25F
→
08/24 17:24, , 26F
有一種方式是用洗瓶將buffer灌到well中wash,不要直沖well底面
08/24 17:24, 26F
→
08/24 17:25, , 27F
之後甩掉buffer,並在擦手紙上拍打,這個方法沒有問題。倒是要注
08/24 17:25, 27F
→
08/24 17:27, , 28F
意若沒有拍乾(指well中沒有殘留液體，並非完全乾燥)實驗數據再
08/24 17:27, 28F
→
08/24 17:29, , 29F
現性不佳。實地看別人全程操作一次或換手做做看，可略知是產品
08/24 17:29, 29F
→
08/24 17:30, , 30F
有問題抑或操作手法待改善。
08/24 17:30, 30F
推
08/27 08:02, , 31F
八爪使用前可以檢查一下O ring ,把tip插緊（不管吸
08/27 08:02, 31F
→
08/27 08:02, , 32F
或加都一樣）
08/27 08:02, 32F
→
08/28 15:07, , 33F
實驗室有其它前輩做出過嗎？
08/28 15:07, 33F
‣ 更多 wig152003 的文章
文章代碼(AID): #1I4tP2jf (Biotech)