[求救] DNA gel bands 的 pattern 很奇怪

看板Biotech作者 (......)時間11年前 (2013/07/03 16:58), 編輯推噓4(4推 0噓 14→)
留言18則, 11人參與, 最新討論串1/1
我抽了幾個經不同處理的細胞的RNA， 再用RT kit轉成 cDNA, 接著跑PCR 我的做法是各取等量的templet到PCR管中，再將混合好的Taq, primer. dNTP等量加到 每個PCR tubes裡，接著votex、spin down，就放到PCR machine中進行反應。 跑膠之後,卻出現奇怪的情形 1.出現多條band 2.sample的band有兩種截然不同的pattern （1, 6, 9 lane) 附上照片http://www.wretch.cc/album/show.php?i=wch10211021&b=2&f=1408039934&p=0 看起來似乎問題不只一個，完全沒有頭緒該從哪裡開始troubleshotting 希望版上的前輩可以幫忙解惑！ 謝謝 ！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.121.113
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07/03 17:21, , 1F
P個nested看看?
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07/03 17:23, , 2F
預期的band是多大呢?
07/03 17:23, 2F
推
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原po轉多少的RNA阿
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07/03 21:20, , 4F
有一說是不要vortex，怕enzyme壞掉
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07/03 22:29, , 5F
有沒有可能是電極線的問題啊.?有試了control嗎?
07/03 22:29, 5F
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07/03 23:23, , 6F
轉cDNA 有用到 random primer 嗎?
07/03 23:23, 6F
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07/04 11:50, , 7F
用了哪些primer呢？專一性夠不夠？
07/04 11:50, 7F
推
07/04 11:56, , 8F
請問您的膠是不是沒有讓它硬夠？
07/04 11:56, 8F
推
07/04 22:00, , 9F
可愛的波浪造型 所以問題是電泳出現波浪嗎?
07/04 22:00, 9F
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07/05 16:15, , 10F
其實vortex個極短時間不太會破壞enzyme，不要高速vortex
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07/05 16:16, , 11F
10秒這種就好，通常我是會vortex 1秒左右就停。
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07/05 16:17, , 12F
不過很可能是primers專一性不夠，有可能是有alternative
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07/05 16:17, , 13F
splicing嗎？
07/05 16:17, 13F
推
07/06 00:16, , 14F
band歪是gel作的不好, 沒有搖勻或微波不夠久或沒有solidify夠
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07/06 00:17, , 15F
至於多條band, 可能是anneal temp太低, primer專一性不夠,
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不然就是根本實驗無誤, 是同個mRNA的alternavtive splicing
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不過你沒有提到你預期的band多大,還是根本就是預期有不同大小
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07/06 04:27, , 18F
vortex會破壞enzyme? 那會不會把抗體的手震斷？XD
07/06 04:27, 18F
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