[求救] 配13公分大片膠的注膠問題

看板Biotech作者 (阿精)時間11年前 (2013/06/15 00:56), 編輯推噓3(3推 0噓 24→)
留言27則, 7人參與, 最新討論串1/1
各位好: 因為整個系上只有我一個人做二維電泳 目前遇到一些問題,因此上來這裡請求幫助了! 請不吝指教 非常感謝^^ 目前遇到的最大問題是 跑完第一維的13公分IEF後 要配大片的SDS-PAGE作第二維電泳 我使用的配方是 30%ACRYLAMINE 18.75ML 1.5M TRIS 9.375ML DD WATER 9.375 ML 1% APS 375uL TEMED 18.75% 就是含有15%的ACRYLAMINE的膠 配完後有充分的震盪均勻 再拿塑膠吸管去注膠 兩片玻璃片也先用95%酒精擦拭過了... 兩側的SPACER是比較厚的那種.. 當我注完膠之後 馬上用異丙醇壓膠等待下膠凝固 問題就是: 膠的最上層的兩側角角應該要是直角形的!! 但我的膠凝固後 兩邊的角角都是往下凹的 呈圓弧狀@@ 配了好幾次都會變成圓弧的角 這樣我放吸了MARKER的濾紙片都會往旁邊倒.歪歪的 跑出來的MARKER超級扭曲 好醜! 請問有甚麼技巧可以讓膠注的好? 可以有直角... 若是我減少APS的量 讓他凝固速度變慢,這樣可以改善嗎? 或是我壓膠的速度放慢呢? 謝謝耐心看完文章^^ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.227.242.49
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06/15 01:35, , 1F
這組成，你的gel配方跟一般的PAGE本來就不一樣嗎？APS好低
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06/15 09:25, , 2F
兩邊往下凹表示底下會漏...
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※ 編輯: mary1017 來自: 140.116.162.76 (06/15 19:08)
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06/15 21:14, , 3F
充分震盪均勻 <== 這樣不會有小氣泡嘛?
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上層會有泡泡 我都先從下層開始吸 最後配完會剩一些
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但是我沒有漏膠的狀況...
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06/15 21:36, , 6F
之前配小片7公分的膠 漏膠時也是一起往下降的說 @@
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推
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2D大片膠氣泡問題只要搖一搖敲一敲,氣泡就浮上來了
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06/16 11:55, , 8F
會不會是你上方的spacer跟玻璃的密合有差
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兩側的夾?子 (可以轉緊的那種) 和玻璃片,spacer同樣長度
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不過我把異丙醇掉到,換成running buffer時 會看到膠的上
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層和玻璃片之間有氣泡出現
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然後就會看到某邊的角陷下去變成圓弧形的了 @@
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還是改成從中間處加異丙醇呢? 之前都是由一側spacer緊貼
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的加異丙醇壓膠,然後那側就會凹陷....
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所有溶液有恢復到室溫再開始配嗎
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推
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震盪完要先抽氣，再加入APS和TEMED
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推
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我回想起以前作2D的慘痛日子了...
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你跑一維是用strip嗎?
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的確我以前在作很靠近邊邊,膠也會有點圓弧
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但是我記得strip比膠還短的多
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你可以先放水在放strip接著吸乾水,放maker
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最後在倒agarose把他封起來
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其實maker稍醜無所謂,重要的是你最後的蛋白點
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所以你稍微調整一下maker,strip在膠上的位置,應該改善
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我之前作Maker都擺得很正沒東倒西歪過
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回KAKAMAN:我是用13公分的strip跑第一維..但strip兩端塑膠片剪掉後放到SDS PAGE上 的時後就只剩一點點的位子可以放濾紙了 @@ 我是先把異丙醇倒掉..換成RUNNGING BUFFER 加到滿~接下來把STRIP放下去, 等它沉下去之後,再用針頭把BUFFER盡量吸乾 最後放濾紙 ※ 編輯: mary1017 來自: 140.116.162.76 (06/17 18:07) 這次我有把配膠的溶液都放到常溫之下 並且改成從中間的部分去LOADING異丙醇... 膠凝固後,沒有之前出現的圓弧形角角了! 希望下次還可以作成功! 很謝謝大家的幫忙 ^^ 十分感謝! ※ 編輯: mary1017 來自: 140.116.162.76 (06/17 18:11) ※ 編輯: mary1017 來自: 140.116.162.76 (06/17 18:13)
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06/17 22:10, , 26F
異丙醇倒掉有沒有先用二次水沖過啊?
06/17 22:10, 26F
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06/18 00:06, , 27F
我有用running buffer洗過
06/18 00:06, 27F
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