[求救] Western的 band看起來非常怪

看板Biotech作者 (吱吱)時間11年前 (2013/06/13 16:53), 編輯推噓9(9推 0噓 15→)
留言24則, 7人參與, 最新討論串1/1
我是做p67 phox的膜蛋白 之前實驗室沒有做過這個蛋白 (抗體 是用santa cruz 的 sc15342 這支) 用pierce的kit抽膜蛋白 用10% 的 sds page去跑 blocking 用5% 脫脂牛奶 (室溫搖一個小時) 抗體的稀釋是用 3% bsa以1:1000稀釋 (4度C overnight) wash 是用 TBST洗 二抗是1:10000稀釋 (用5%脫脂牛奶稀釋) 使用uvp 照膠 我的問題band 都連在一起而且還糊糊的(如圖http://i.imgur.com/fZeKPzm.png) 可是我的actin 就沒有這樣耶 (他們在同一片膠上) actin 的band很正常 請問一下為什麼會這樣?? 有什麼解決的方法嗎??謝謝 -- 當他們關掉MegaUpload的時候， 我保持沉默；我還有FileSonic。 當他們關掉FileSonic的時候， 我保持沉默；我還有FileServe。 當他們關掉FileServe的時候， 我保持沉默；我還有MediaFire。 當他們關掉MediaFire的時候， 我保持沉默；我還有BT。 當他們關掉BT伺服器的時候， 我已一無所有了。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.104.161
推
06/13 18:10, , 1F
有 actin的圖嗎
06/13 18:10, 1F
補ACTIN的圖 http://imgur.com/GsH6Do3
感謝你 ※ 編輯: TW185930 來自: 140.120.104.161 (06/13 19:33)
推
06/13 21:48, , 2F
lysis buffer 確認一下 以前配錯buffer 有跑出這樣來過
06/13 21:48, 2F
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06/13 21:49, , 3F
分子量較大的就像你這樣 ACTIN都很正常~
06/13 21:49, 3F
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06/13 21:57, , 4F
我猜不會是buffer,因為marker也是,而且這個p67跟actin的MW
06/13 21:57, 4F
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06/13 21:58, , 5F
連差1倍都不到,很難說分子量影響
06/13 21:58, 5F
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06/13 22:06, , 6F
我想猜把BSA換成milk就好
06/13 22:06, 6F
推
06/13 23:53, , 7F
........其實我直接猜是因為SC的抗體XDDDD
06/13 23:53, 7F
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06/13 23:54, , 8F
另外..膜蛋白用Actin做internal?
06/13 23:54, 8F
推
06/14 11:52, , 9F
應該是GEL裁太小塊 transfer的時候店場不均勻所造成
06/14 11:52, 9F
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06/14 11:52, , 10F
你可以試試看不要裁直接transfer
06/14 11:52, 10F
感謝mingchao blence martyrtitan puec2 好! 我試試看! ※ 編輯: TW185930 來自: 140.120.104.161 (06/14 13:30) ※ 編輯: TW185930 來自: 140.120.104.161 (06/14 13:38)
推
06/16 11:59, , 11F
膜蛋白應該要用membrane上的一些pump作control吧
06/16 11:59, 11F
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06/16 12:01, , 12F
另外膜蛋白你用什麼方式煮?
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06/16 12:02, , 13F
之前我在作600KDa的膜蛋白時,有位老師跟我說膜蛋白
06/16 12:02, 13F
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06/16 12:04, , 14F
加sample buffer用37度西煮半小時
06/16 12:04, 14F
推
06/16 21:35, , 15F
membrane protein很容易聚集 要小心
06/16 21:35, 15F
推
06/17 12:54, , 16F
你是抽哪種膜蛋白? 如果是plasma membrane不該跑的出actin!
06/17 12:54, 16F
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06/17 12:56, , 17F
如果是organelle membrane (ER or Golgi)那就OK.
06/17 12:56, 17F
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06/17 12:58, , 18F
假設你的一抗品質沒問題,我建議用RIPA製備protein lysates
06/17 12:58, 18F
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06/17 12:59, , 19F
之後再用sonicater確定充分的lyze membrane protein.
06/17 12:59, 19F
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06/17 13:00, , 20F
transfer應該問題不大 不然actin 不會如此漂亮
06/17 13:00, 20F
推
06/17 13:03, , 21F
不過你的kit如果只能isolate membrane protein 的話
06/17 13:03, 21F
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06/17 13:04, , 22F
即使你收的是ER或Golgi你還是不能用actin.有可能是個不好kit
06/17 13:04, 22F
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06/17 13:05, , 23F
有一大堆cytosolic protein contamination.
06/17 13:05, 23F
我是抽NADPH氧化酶(細胞膜上的蛋白)， 我老師堅持說要 以actin當作control ...... ※ 編輯: TW185930 來自: 140.120.104.161 (06/17 14:53)
推
06/26 20:57, , 24F
還是你要上超高速去做fractination?
06/26 20:57, 24F
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