[求救] RT-PCR

看板Biotech作者 (kelly2013)時間11年前 (2013/05/13 13:20), 編輯推噓7(7推 0噓 16→)
留言23則, 9人參與, 最新討論串1/1
拜託大家幫幫我,這關係到我能否順利畢業,這裡先跟大家說一聲謝謝 我的細胞株使用神經膠質母細胞瘤,用不同濃度的藥處理後, 再用Trizol去純化RNA,然後測O.D.260/280, 每一個sample RNA conc固定為1, 接著再把RNA轉成cDNA做RT-PCR 因為我臨時出了一些狀況,所以mRNA純化成cDNA後就一直冰在4度c冰箱 我想說已經轉成cDNA,應該會很stable....所以它就躺在4度C冰箱整整一個月 昨天我把它拿出來做PCR時,internal control(我是使用GAPDH當internal control) 完全沒有equal,每個sample bend的粗細相異很大,還呈現不規則.... 想拜託大家幫幫我,現在有沒有甚麼辦法可以挽救? 因為internal control差異那麼大, 根本無法說服別人相信我的數據 在此先謝謝大家 ※ 編輯: kelly2013 來自: 192.192.90.30 (05/13 13:26)
推
05/13 13:46, , 1F
改用Q-PCR, 或換control (如果你的藥會影響的話)
05/13 13:46, 1F
推
05/13 14:52, , 2F
同樓上,先確定你的藥會不會誘發GAPDH. 再來是放4度的問題,
05/13 14:52, 2F
→
05/13 14:53, , 3F
你的CDNA是用H2O elute嗎? 那在4度C放這麼久有可能會acid
05/13 14:53, 3F
→
05/13 14:53, , 4F
hydrolysis. 如果這樣的話你的cDNA量就不準了
05/13 14:53, 4F
我是用水溶的
→
05/13 14:54, , 5F
如果cDNA是在TE裡面會比較stable,但放那麼久也難說,尤其你要
05/13 14:54, 5F
→
05/13 14:55, , 6F
定量. 想必mRNA應該是安全的冰在-20或-80吧,何不重新作cDNA?
05/13 14:55, 6F
這一批sample轉cDNA 後的mRNA是冰在-80冰箱 可是mRNA更不穩定,至少已經放在冰箱兩個月了, 萬一之前轉cDNA過程中有甚麼閃失... 放那麼久的mRNA我真的不太敢再使用(因為我的sample加起來有將近六十管) 花時間事小,萬一轉失敗,一定會被罵浪費材料 可是重收細胞還要花很多時間 時間根本來不及... ※ 編輯: kelly2013 來自: 192.192.90.30 (05/13 17:59)
推
05/13 19:04, , 7F
RNA放在-80兩個月還ok吧
05/13 19:04, 7F
→
05/13 19:04, , 8F
可以先轉個一兩管試試看阿
05/13 19:04, 8F
推
05/13 20:53, , 9F
有時間擔心轉失敗卻沒時間重收細胞，現在擺明東西不能用
05/13 20:53, 9F
→
05/13 20:54, , 10F
你也只剩下重轉的選項而已了不瞞您說。
05/13 20:54, 10F
不是我不重收細胞,細胞不是我管控,不是說要就會有 而且因為一次要處理那麼多盤, 下禮拜就要口試再怎麼熬夜都來不及 所以才會想上來求救有沒有人有類似的經驗救成功的例子
推
05/13 23:15, , 11F
2個月OK拉~~~快快重轉吧
05/13 23:15, 11F
甚麼兩個月? ※ 編輯: kelly2013 來自: 192.192.90.30 (05/13 23:16)
→
05/13 23:16, , 12F
大不了先轉個幾管測試一下, 確認OK後再轉完剩下的
05/13 23:16, 12F
→
05/13 23:29, , 13F
RNA放在-80兩個月比cDNA放4度一個月好多了 重轉就對了
05/13 23:29, 13F
推
05/13 23:33, , 14F
RNA -80兩個月,
05/13 23:33, 14F
→
05/14 00:21, , 15F
兩個月還好啦!!之前老師要補舊東西半年多前的RNA也沒問題
05/14 00:21, 15F
那O.D.260/280需要重測嗎? 我想先跟大家確認一下, 如果這個細胞加藥後確定GAPDH表現量是equal 但PCR結果卻是不equal... 這主要是因為我把cDNA放在四度C冰箱太久的緣故嗎? 有沒有可能是別的原因? 我本來想說是我手殘,所以又重新p一次GAPDH 但我發現第二次的結果跟第一次結果其實差異不大... 另外我想問一下,如果跑純化RNA後跑RNA電泳去看RNA的quality 如果18S跟28S位置的bend沒有很漂亮的話 是否代表這樣轉cDNA的quality也不會很好? 在這裡先感謝大家的幫忙 ※ 編輯: kelly2013 來自: 192.192.90.30 (05/14 01:03)
推
05/14 08:39, , 16F
我不太清楚你為什麼這麼堅持地想要在cDNA品質上做文章
05/14 08:39, 16F
因為我認為如果cDNA品質不好,可能會影響PCR的結果
→
05/14 08:39, , 17F
但是現在很明顯你對你的材料並不很有信心，保存上也有瑕疵
05/14 08:39, 17F
→
05/14 08:40, , 18F
重複兩次PCR結果相同，程度上代表你實驗操作問題不大
05/14 08:40, 18F
→
05/14 08:40, , 19F
我想cDNA品質不佳的問題越來越明顯了，不是嘛？
05/14 08:40, 19F
→
05/14 08:41, , 20F
另RNA電泳18S/28S band不漂亮，確實轉cDNA效果會較差。
05/14 08:41, 20F
→
05/14 08:41, , 21F
但如果細胞取得不易，那你的選擇也不很多，先轉就是了。
05/14 08:41, 21F
※ 編輯: kelly2013 來自: 192.192.90.30 (05/14 10:49)
→
05/14 12:03, , 22F
沒得選擇就只能重轉啦!! RNA濃度要再測一次
05/14 12:03, 22F
→
05/14 23:06, , 23F
RNA放-80一年都沒問題 如果一開始SAMPLE就是OK的話
05/14 23:06, 23F
‣ 更多 kelly2013 的文章
文章代碼(AID): #1Ha7WYIl (Biotech)