[求救] HepG2 生長問題

看板Biotech作者 (阿徐)時間13年前 (2013/02/27 18:21), 編輯推噓5(5推 0噓 13→)
留言18則, 8人參與, 最新討論串1/1
培養方法----- 解凍:凍管自液態氮取出後迅速於37度解凍,拿出來後2分鐘內解凍完畢 然後用pipete吸取放入flask中 培養:解凍後24小時換液將DMSO移除,之後接著養到flask內細胞九分滿 繼代:將舊medium移除,用PBS洗去殘餘medium,接著用trypsin-EDTA於37度作用1.5-2分鐘 (trypsin買的時候是10X,使用時以1mlPBS對0.1ml稀釋) 接著以一分二的密度分盤 每兩天會換一次MEDIUM 問題1>作用兩分鐘是否太久??板上有大大作用1分鐘即可?? 問題2>medium目前使用DMEM,paper也有人用MEM或RPMI,請問有人養過覺得哪個好呢?? 目前最大問題3>在解凍後至第二代都還可以,可是再到第三代後生長變得很慢甚至沒長 但他也沒有浮起來或死亡,但好像會漸漸死亡 請問是我的方法有問題嗎?? 因為前一陣子養都還好 目前唯一的不同就是血清換了新的批號,trypsin 也換了一種 這兩個會影響嗎?? 實在是已經不知道怎麼辦了..... 請各位大人幫小的解答 (跪 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.127.19.160 ※ 編輯: bread75312 來自: 140.127.19.160 (02/27 18:24)
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1.沒算時間，看到全融沒浮冰就會馬上拿出來
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實驗看起來沒太大問題，跟鄰居交換血清試試看
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DMSO在24小時後才移除？凍細胞時至少5%以上，我都2小時就換
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或者說細胞貼盤以後就換，總之不會超過5小時才換就是了
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推
02/28 14:31, , 5F
我養HepG2步驟都跟你差不多,只是用的medium是RPMI,繼代時
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甚至都是1x trypsin切10分鐘,沒有發生過不生長的情形
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DMSO在24小時後才移除沒有問題喔,食工所也是這樣建議
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還有生長緩慢或不生長也要考慮是否有Mycoplasma汙染
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感謝各位大人!! 小的還有思考是不是繼代數已達上限??
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因實驗室細胞株也都是從別的實驗是拿來養的
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推
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HepG2應該比較不會有繼代數的問題
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重新看了一下，我覺得你先去確認到底medium是否用對，未經馴
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化而使用錯誤的medium真的在養個兩三代以後就會開始很不健康
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我覺得是血清~跟隔壁家借一下血清吧!
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我在水浴解凍的時候 只要內容物會移動 就開始拿去操作台
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操作後續步驟 不會等到全部融解 給你參考看看
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我養HepG2 trypsin都切超久的耶 XD
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03/04 15:21, , 18F
感謝各位解答!!會去試試看其他方法的!!
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