[方法] 從完整Plasmid取得Vector Alone的方法
最近取得一個plasmid，裏頭已帶有我要的基因
而此基因是利用兩種不同的限制切位所接進去的
但是我沒有vector alone作為實驗的control
所以必須將此plasmid的insert剔除
為了取得這個『空的vector』
請問各位有何較有效率的方法?
我所想到的策略是
將此plasmid進行酶切，以gel extraction取得vector部分...
1. 合成一股帶有此兩限制切位的oligo，酶切後與vector一起Ligation
問題：一般訂購的Oligo(primer?)為ssDNA，要如何自行處理成dsDNA
(廠商那邊不知道是否能夠幫我解決此問題)
合成的oligo片段很小，酶切後不知是否能順利回收片段
2. 直接將linear的vector進行Ligation
就像平常cloning時，沒有insert的對照組也會些微self-ligate的情況...
問題：理論上可行，但不知實際效率如何...
不知道這種實驗有何較好的做法呢?
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 120.126.57.138
※ 編輯: michaelhsien 來自: 120.126.57.138 (12/10 16:32)
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回復CD133:
此reaction只要buffer, 和pfu就好了? 需要加dNTP嗎?
之前有做過類似的實驗，是A tailing...是用Taq pol做的，須外加dATP
另外，之前好像有kit可以直接做blunt end cloning (類似TA cloning的目的)
其中有個反應，可將sticky end反應成blunt end的步驟
我再去查一下好了，謝謝你給我這個ideal
※ 編輯: michaelhsien 來自: 120.126.57.138 (12/13 10:43)
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