[求救]小片段DNA(100bp)染內染沒東西

看板Biotech作者 (１１１天後才能發ｍｍ版)時間11年前 (2012/12/10 11:00), 編輯推噓3(3推 0噓 8→)
留言11則, 4人參與, 最新討論串1/1
不好意思 我的載體是pET21a 片段大小約100bp 我利用先前加入的切位(設計時加入)切不到片段 但利用PCR卻p的出來 然後利用其他的內切位 確認 (若有接入為200bp，沒有則只切的下100bp) 切的下200bp的片段 我到底發生什麼事了..... 各位大大謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.213.240 ※ 編輯: oCrazyDucko 來自: 140.120.213.240 (12/10 11:01) ※ 編輯: oCrazyDucko 來自: 140.120.213.240 (12/10 11:01)
推
12/10 11:34, , 1F
可能只是看不到：1.提高plasmid作用濃度至10ug
12/10 11:34, 1F
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12/10 11:35, , 2F
2.跑膠時間不要太久，100v for 5~8 mins就先去照膠
12/10 11:35, 2F
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12/10 11:50, , 3F
我沒去測過濃度 不過我都是養菌O/N 取3cc 用kit抽
12/10 11:50, 3F
請問這樣夠嗎? ※ 編輯: oCrazyDucko 來自: 140.120.213.240 (12/10 11:50)
推
12/10 13:23, , 4F
pET21a約5.5kb，取1ug去切也只能得到20ng insert
12/10 13:23, 4F
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12/10 13:23, , 5F
跑膠可能會看不清楚
12/10 13:23, 5F
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12/10 13:24, , 6F
所以可以試試看提高反應的量
12/10 13:24, 6F
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12/10 13:25, , 7F
plasmid夠不夠跟elute體積與拿去切RE的量有關,跟抽幾cc無關
12/10 13:25, 7F
恩 這個我知道 可能是太心急了沒交代清楚 真的很不好意思 我可能養大量一點 測看看濃度吧 那可以請問大概要多少ng or ug 100bp 才能看得清楚呢 ※ 編輯: oCrazyDucko 來自: 140.120.213.240 (12/10 14:50)
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12/10 17:54, , 8F
一般lab做agarose染EtBr的靈敏度約10ng,內染的膠跑越久EtBr
12/10 17:54, 8F
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12/10 17:55, , 9F
會越往上,往下跑的band就更弱更難看到,可以從k板友的算法
12/10 17:55, 9F
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12/10 17:57, , 10F
計算若要有目視易見的band,每個well需要切多少plasmid才夠
12/10 17:57, 10F
推
12/10 20:55, , 11F
EtBr外染比內染來得更靈敏,片段小試著用外染看看
12/10 20:55, 11F
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