[求救] SNP 限制酶切(CAPS)相關問題

看板Biotech作者 ( )時間11年前 (2012/11/07 18:26), 編輯推噓5(5推 0噓 25→)
留言30則, 6人參與, 最新討論串1/1
想請問一下大家 目前在做SNP相關的實驗 想利用限制酶的方法來確認是否有SNP primer設計好了 也放下去PCR了 但是在加了限制酶後去跑膠 pattern變得很霧 我的方法是PCR完後 直接加酵素和buffer 37度作用2小時候跑膠 不知道這邊是不是有什麼其他要注意的地方 還是應該先跑膠elute後再酵素切 希望有經驗的人可以幫忙指點迷津~~ 謝謝喔!!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.235.106
推
11/07 18:26, , 1F
你怎麼知道有沒有amplification?? buffer環境也不同阿
11/07 18:26, 1F
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11/07 18:27, , 2F
最少也clean up或是EtOH precipitation吧~
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11/07 18:28, , 3F
然後膠是跑幾%？產物多大？
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11/07 18:31, , 4F
是要純化最好沒錯，不知道有沒有簡便的方法呢??因為實
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11/07 18:32, , 5F
驗室在這邊都沒有相關經驗。膠是做2% 產物是兩百bp
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11/07 18:33, , 6F
切完大概要往下掉20幾個bp
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11/07 20:09, , 7F
你不是要簡便方法,而是要自己試條件,請先確認PCR完產物狀況
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11/07 20:11, , 8F
產物品質不好,或不是單一band,後續怎麼做? 另外PCR產物直接
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11/07 20:12, , 9F
切RE還要考量產物的salt等對於RE作用的影響或改變RE專一性
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11/07 20:14, , 10F
請先PCR產量最佳化後取極少體積切RE,這樣才能達到要的效果
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推
11/07 20:28, , 11F
我不懂做實驗為什麼要考慮「簡便」，而不是正確性。
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11/07 21:05, , 12F
有同時做一組control確定產物是沒問題的，單一band,大
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11/07 21:06, , 13F
小也是對的! 會提到"簡便"是因為後續檢體會很多，想了
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解是否在這方面大家是怎麼去克服的或是直接點出我錯誤
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切酵素的buffer環境會造成專一性改變，有些酵素會變成亂切
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11/07 21:12, , 16F
NEB酵素的網頁都會有些特別提醒喔！
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11/07 21:13, , 17F
的作法!謝謝大家喔所以原理上PCR產物不能直接酵素切喔?
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11/07 21:25, , 18F
在目前SNParray或MALDI-TOF等大規模定SNP年代以前,傳統都是
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11/07 21:26, , 19F
直接把PCR產物拿去切RE,沒那麼多時間純化,不過都要花時間試
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11/07 21:28, , 20F
應該說連taqman出來之前都用這樣的PCR-RFLP看SNP的
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推
11/08 01:21, , 21F
你取多少PCR product去切? 可能PCR buffer中的鹽離子會影響
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11/08 01:23, , 22F
到RE的反應 反應的體積也要注意 避免star effect...
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11/08 01:25, , 23F
PCR產物直接切是OK的
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推
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稀釋倍數要試條件，如果是已經確定pattern，就免純化
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11/09 14:44, , 25F
PCR出來的總體積是25ul，我取10出來切，體積補到20ul去
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11/09 14:44, , 26F
酵素反應，剩下10ul當control；昨天試過用純化，的確
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11/09 14:46, , 27F
band看起來很OK，可是重點...他沒切 囧，跟control比，
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不但沒切還往上shift一點，請問是因為鹽離子影響嗎?還
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11/09 14:49, , 29F
是??? 囧囧囧
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推
11/10 15:23, , 30F
RE buffer中鹽離子的關係會影響到跑膠的pattern
11/10 15:23, 30F
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