[求救] 關於western

看板Biotech作者 (reporter)時間13年前 (2012/10/25 23:12), 編輯推噓2(2推 0噓 9→)
留言11則, 4人參與, 最新討論串1/1
大家好 我想請問一下大家在跑western時, 1.同一片gel最多看幾種蛋白? 2.如果同一片gel同時想看三種蛋白, 分子量分別為110,50,21kD,那acrylamide需要做幾%? 3. 如果同一片gel同時想看2種蛋白,分子量分別為110,21kD那我acrylamide需要做幾%? 4.我的蛋白是從culture cell 中純化出來的, 我想請教大家一般sample至少需要加多少uL(我們實驗室蛋白沒有定量直接取) 5.如果western做出來,壓完片後,同一片膠(3種蛋白),某些蛋白會一大坨, 但某些蛋白的band會一格一格的就很漂亮,遇到這種情形我該如何改進? 非常謝謝大家的回答 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
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10/25 23:20, , 1F
1)看你的剪刀技術與gel大小; 2,3)11.5~12%; 4)適量多退少補
10/25 23:20, 1F
我想請問一下,一般都是如何決定acrylamide的%? 如果同一片膠,我想看的蛋白最大是110kD最小是21kD, 我選擇12% 的acrylamide gel... 那110kDa 的那個蛋白transfer完後,量會不會變少?或者通通擠在一起? 謝謝大家的解答
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10/25 23:21, , 2F
5)細胞內各種蛋白本來差異就大,最好的方法只有調整抗體濃度
10/25 23:21, 2F
原來是從抗體下手,謝謝你的提醒,我以為把蛋白的量減少就可以解決了 ※ 編輯: reporter0124 來自: 210.60.122.200 (10/25 23:34)
推
10/25 23:37, , 3F
不知道你們老闆會不會接受這樣 但我們是transfer完 把膜剪
10/25 23:37, 3F
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10/25 23:37, , 4F
開分別hy你想要看的蛋白的抗體這樣你就可以調整每個抗體的
10/25 23:37, 4F
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10/25 23:38, , 5F
titer 壓片的時候也可以分別壓 才不會有些band粗 有些細
10/25 23:38, 5F
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10/25 23:39, , 6F
也因為membrane剪開 所以我們用五金行賣的那種塑膠盒(分一
10/25 23:39, 6F
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10/25 23:40, , 7F
一格長條型 一格放一種抗體 體機很小所以很省一抗)
10/25 23:40, 7F
我現在的確是這樣做,所以我才能一片gel同時看3種蛋白 只是結果出來後,同一片gel,用抗體去hy,同一片gel有些蛋白的band很粗,甚至一坨, 但有些蛋白的band就剛剛好 你說壓片分開壓? 不是都排在casette裡面,依time cost(1,3,5,15min)一起壓嗎? ※ 編輯: reporter0124 來自: 210.60.122.200 (10/26 02:02)
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10/26 02:44, , 8F
恩恩 在同一個casette一起壓 但是不同蛋白會挑不同的時間點
10/26 02:44, 8F
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10/26 11:02, , 9F
用gradient gel 會比較漂亮 不一定要同時壓片 先壓量比
10/26 11:02, 9F
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10/26 11:04, , 10F
較少的蛋白 strip後 再壓量比較多的 可以strip數次都OK
10/26 11:04, 10F
推
10/26 13:26, , 11F
你可以跑梯度膠啊…做梯度膠這些就
10/26 13:26, 11F
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