[求救] 有人用過中研院的shRNA嗎?

看板Biotech作者 (努力賺錢)時間13年前 (2012/10/09 15:11), 編輯推噓2(2推 0噓 5→)
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之前有爬過文 大家拿到中研院的shRNA後好像都是直接做 有人是拿到之後將shRNA切下來接到其他的vector嗎? 由於實驗需要 我訂了中研院的shRNA 以後用vector上的NdeI與EcoRI將shRNA切下 size約130bp 但是切下來後看不到130的地方有band shRNA的量我用1ug去切 切了好幾次 頂多只看到200bp的地方有band但是會糊糊的 gel extraction後的濃度只有6ng/ul 有試著ligation與transform 但塗plate後沒長東西 shRNA的序列有先去定序了 確定序列上是有NdeI與EcoRI兩個切位 然後我要接進去的vector大概是8kb 已經切好多次啦但還是不行>"< 不知道有沒有人這樣做過成功的拜託告訴我 另外酵素是用NEB的 都是新的 所以應該沒有放太久壞掉的問題 麻煩大家了Orz -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.61.106
推
10/09 15:41, , 1F
insert size這麼小會很不好接 而且照gel時訊號會很弱
10/09 15:41, 1F
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10/09 15:42, , 2F
從描述看來應該是insert量不夠的問題
10/09 15:42, 2F
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10/09 16:27, , 3F
pLKO至少7kbp,切1ug頂多拿到60ng,elute更不可能拿到6ng/ul
10/09 16:27, 3F
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10/09 16:30, , 4F
除非你用8ul或更少去elute,而且也濃度跑膠也不可能看到東西
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10/09 16:33, , 5F
如果長度只有130bp,拿plasmid去PCR後直接切與接或許較方便
10/09 16:33, 5F
推
10/09 17:05, , 6F
樓上專業
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10/09 17:30, , 7F
好謝謝各位的意見 我會試著用PCR放大的方式去做做看
10/09 17:30, 7F
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