[求救] ligation求救

看板Biotech作者 (風)時間11年前 (2012/09/14 10:36), 編輯推噓4(4推 0噓 16→)
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我的insert約2.7kb, vector 5.9kb doule digest overnight vector use gel clean(因為切兩刀後會掉下約500bp) ligation 比例 insert:vector=3:1 , 6:1 於室溫下反應45min~1hr transformation 加10ul ligation solution到complete cell(市售的) ->冰浴 -> heat shock 90sec -> 冰浴 -> 加LB(不含Amp)培養 ->塗盤 隔天收盤時,每盤約只長不到10顆 而且都不是我要的 有把ligation solution拿去跑膠 看起來都沒有band 感覺是沒有接上去的樣子 = = 有換過另一個vector 兩個切位就在旁邊酵素切完, clean , CIP 收盤時菌落是比較多了 但看起來都是原本的質體 insert 沒有接上去阿 = = 是因為inssert 片段比較長 所以比較不好接嗎? 想請問 有建議的ligation方法(時間.溫度....)嗎?? 我已經前前後做了快半年了(中間有在改東西) 做到都快發瘋了 嗚嗚 感謝大家!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.123.126.53
推
09/14 10:47, , 1F
1.insert跟vector回收完有測濃度嗎？ 有跑膠嗎？
09/14 10:47, 1F
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09/14 10:47, , 2F
2.ligation可用16度 overnight
09/14 10:47, 2F
推
09/14 10:51, , 3F
3.一般一管勝任細胞加1-2μL的DNA就夠了 頂多4μl
09/14 10:51, 3F
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09/14 10:51, , 4F
10μL貌似太多了點 而且你有recover還是長那麼少蠻怪的
09/14 10:51, 4F
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09/14 11:18, , 5F
回收完有測濃度,ligation時二者皆>200ng
09/14 11:18, 5F
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09/14 11:25, , 6F
RE site是什麼?
09/14 11:25, 6F
推
09/14 11:37, , 7F
1. ligation的比例是重量還是莫耳數？
09/14 11:37, 7F
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09/14 11:38, , 8F
2. 請各個步驟都加做positive control，才能troubleshootin
09/14 11:38, 8F
推
09/14 12:52, , 9F
3:1是指molar ratio,請回算成mole,NEB ligase用16度o/n
09/14 12:52, 9F
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09/14 12:52, , 10F
fermentas ligase是22度~不要用錯了
09/14 12:52, 10F
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09/15 22:56, , 11F
勝任細胞效率多少? 抗生素確定沒錯? 抗生素濃度多少?
09/15 22:56, 11F
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09/17 00:47, , 12F
"ligation時二者皆>200ng"顯示你們的cloning很多是問題造成
09/17 00:47, 12F
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09/17 00:51, , 13F
可能要找其他lab重新從enzyme digest到ligation檢查問題
09/17 00:51, 13F
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09/19 10:50, , 14F
RE site是XbaI和EcoRI
09/19 10:50, 14F
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09/19 10:59, , 15F
RE site是XbaI和EcoRI 勝任細胞是買市售的
09/19 10:59, 15F
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09/19 11:01, , 16F
抗生素濃度為50ug/ml
09/19 11:01, 16F
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09/19 11:02, , 17F
ligation比例是用莫耳數比
09/19 11:02, 17F
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09/19 21:50, , 18F
vector會不會XbaI沒切，因為XbaI會切不動dam甲基化的
09/19 21:50, 18F
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09/19 21:50, , 19F
序列,有先確認過序列了嗎?
09/19 21:50, 19F
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09/19 22:17, , 20F
在NEB DDF table, 基本型XbaI跟EcoRI不能一起切......
09/19 22:17, 20F
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