[求救] RT-PCR從有band到smear

看板Biotech作者 (。)時間12年前 (2012/06/04 16:02), 編輯推噓4(4推 0噓 29→)
留言33則, 6人參與, 最新討論串1/1
最近一直陷入reverse-transcriptase無限P不出來的地獄中， 故想請教有無版友有相關經驗或可能的解決方法。 目前的狀況是，我在測試樣品中的ㄧ個target mRNA表現， 其cDNA大約331 bp， 在測試兩、三種primer後決定了其中一個專一性還不錯的primer， 其為22-mer，GC content為52%，annealing溫度為60度C， 一開始有順利P到我預期想看的產物， 但就在上個月初開始， 產物呈現整個smear的狀況， 但同時間， ladder marker正常，所以我配置的膠片應該ok (2% agarose gel)， internal control (G3DPH)的表現也ok，所以cDNA樣品理論上應該也ok， 但預期的target mRNA產物就是完全不見了！！！！！ 我目前嘗試過的辦法有： 1) 重新訂製新的primer (序列相同)(試過兩次) 2) 使用新鮮配置的水 (四次水) 3) 換不同台PCR機器進行PCR循環 4) 換訂不同廠商的相同序列primer (試過碩禾和百力) 5) 加1%DMSO下去進行PCR循環 6) 使用不同批抽的RNA轉cDNA樣品進行PCR循環 但結果全都失敗了！ 而且每次做的結果都類似， 就是IC和ladder marker很清楚，但想看的產物整個smear， 大致如此圖所示： http://images.plurk.com/56af144622737aad9f3e922b35175b85.jpg
(左半lane 2-6為IC，右半lane 8-12為預期target mRNA產物) 目前呈現有點走投無路的狀態， 誠摯請教各位版友對此有無任何想法， 非常感謝！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.4.189
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06/04 16:14, , 1F
template太多或是MgCl2濃度太高?
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06/04 16:26, , 2F
我template的濃度10 ng/ul，PCR是使用EconoTaq kit，裡面的
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06/04 16:27, , 3F
MgCl2是3 mM
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所以是可以試試看調整MgCl2的濃度嗎
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06/04 17:24, , 5F
RNA狀況確定OK嗎？
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有用nanodrop重測過其一樣品，濃度達一千多ng/ul
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260/280約1.8，260/230約2.2
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測的樣品都已經轉成cDNA了
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推
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sample是否是馬上抽完就作還是冰凍後解凍再作?
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從你的敘述中 上個月都有 這個月開始不行 會懷疑
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是否是斷掉了 或者被RNase吃掉了 建議重抽馬上作
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如果重抽就做出來了 建議在sample裡加入RNase inhibitor
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我在處理細胞的習慣上，都是當天早上抽RNA，下午轉cDNA和跑
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膠，如果已經轉成cDNA也是有斷掉的可能性嗎？
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另外，我也有擔心cDNA反覆解凍的問題所以在第6點有以另批轉
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的cDNA進行測試，不過結果一樣是smear
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上述的跑膠是跑RNA膠片確認品質，轉cDNA與PCR膠片則後續進行
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推
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GAPDH很清楚的話表示sample沒問題才對
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這樣子像是沒P到 可能沒表現 或是cycle數不夠
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的確有聽過RNA影響到cDNA不耐放的案例
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推
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這麼說好了 control組都有作出來 所以應該不是試劑類出
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狀況 然後primer出問題機率應該不大 因為你之前也批出
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來了 cycle數可能增加一點再試試看
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以前我遇過類似的問題 最後都是出在sample出狀況
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通常放進clone裡的序列 你經由plasmid抽取出來的
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因為經過一些wash的extract過程 所以把鹽類還有有的沒
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的除掉了 所以會比較穩定 如果是RT產物 或者PCR產物
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會比較多變化
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我是直接抽取細胞的RNA，此target mRNA目前的cycle數是40
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我明天試試看提高cycle數，感謝各位！
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※ 編輯: Ritoo 來自: 111.249.202.61 (06/04 23:33)
推
06/05 00:32, , 31F
你的lane8有P出來不是嗎...? cDNA轉完不要放太久
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06/05 00:33, , 32F
單股沒雙股那麼穩定 存不久 看起來是cycle不夠
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06/05 00:35, , 33F
可以試試看提高template與cycle數?
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