[討論] sonication會破壞細胞核嗎?

看板Biotech作者 (edger)時間12年前 (2012/05/26 21:38), 編輯推噓8(8推 0噓 57→)
留言65則, 6人參與, 最新討論串1/1
大家好: 目前在抽293T細胞的蛋白質,要將其分為核蛋白,細胞質蛋白及膜蛋白 我是將細胞懸在浮低張溶液並以dounce homogenizer將細胞打破, 然後低速離心.不過有個問題就是細胞無法破的很完全,因此低速離心後 會和細胞核一起沉澱.所以我想用sonication的方式讓plasma membrane 破裂,但不確定對細胞核有無影響. 我的想法是plasma membrane既然都能被sonication破壞, 細胞核應該 也會受到破壞. 希望聽聽各位的意見 麻煩了 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 122.120.132.179
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05/26 22:36, , 1F
我一直以為sonication的重點是震斷黏黏的DNA..
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要分各區的蛋白, 可以試Thermo的 NE-PER那系列的
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不能用detergent嗎?
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05/26 22:57, , 4F
sonicator大多可以調強度, 強一點絕對可以打破核膜
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推
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不用這樣硬幹吧ˊ_>ˋ 用NP-40就好了
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推
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sonication完才看得到核蛋白....
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破細胞來講 通常sonication就是拿來破核啦
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05/26 23:06, , 8F
你去下載NE-PER的protocol 裡面CERI用你的hypotonic
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05/26 23:07, , 9F
CERII用10% NP-40 NER用high salt buffer 照他流程
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走就可以拿到小體積的分離(I+II完後洗一下pellet可以
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降低NE pellet中cyto的殘餘量, 洗完換到新管可以更
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乾淨) 不建議用sonication是因為拿到核通常是像鼻涕
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一樣黏成一團 超音波對這種分不開的效率不好ˊ_>ˋ
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05/27 08:13, , 14F
謝謝各位,不過我可能沒有表達很好,其實我的重點是要破plasma
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membrane,而不希望把細胞核打破,所以想問說哪種方法可以
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05/27 08:15, , 16F
完全的將細胞打破,卻又不會破壞核膜....謝謝各位
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推
05/27 08:38, , 17F
原來我打的是外星文一.一
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05/27 09:52, , 18F
哈囉 我有上網看了一下NE-PER的nuclear及cytoplasmic protocol
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05/27 09:53, , 19F
如果CERII是10% NP40(detergent),那麼再這一步核膜就已經破掉
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這個時候再去離心核蛋白還是留在supernatant,並沒有分離效果
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所以我想問的是你是不是把CERII和NER兩個搞反了
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無論如何 還是謝謝你的回答
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推
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NP40是破細胞膜的....照他體積下去稀釋最終濃度0.1％
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直接加10%當然會破...
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推
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http://ppt.cc/XbVL 還是我看的是不同份的protocol?
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step3-8完全都是收cyto部分 step9-12才是NE
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哈囉 我們看的是同一個protocol沒錯
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不過11ul,10%的NP40加到210ul CERI,最後的濃度是0.52 %
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05/27 10:43, , 29F
如果照你的推論加NP40不會破的話,那加NER(high salt burrer)
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就更不會破了,也就是照這個protocol走下去,最後凍在-80freezer
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會是沒有破掉的核
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另外CERI如果是hypotonic buffer是合理的,因為細胞膜會破
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就是靠著低張容液將細胞膜撐破,而細胞核有核孔,所以就不會破掉
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一般的protocol都是加完低張溶液,然後1000g離心將核沉澱
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05/27 11:04, , 35F
一般很少會在離心之前加detergent因為濃度低還是可能會破核
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05/27 11:07, , 36F
我個人覺得如果CERII是high salt buffer,NER若是NP40
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那最後凍在-80 freezer會是核蛋白,而不會只是沒有破掉的核
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05/27 11:09, , 38F
最後還是謝謝你提供這個方法,看起來很棒
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推
05/27 11:36, , 39F
NER使用是高鹽份溶液抽出核蛋白 並不是打破核膜方式
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高鹽抽出核蛋白原理Google一下就有 另外核膜有蛋白質
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包覆所以NP40並不會破壞核膜 使用detergent方式破壞
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細胞膜是因為低張溶液只是讓細胞膜稱大到一個極限
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要真正破壞就要破壞CHOLESTEROL對細胞膜的穩定性
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所以才用detergent插入細胞膜達成破壞穩定性效果
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不使用detergent就用物理性破壞例如針頭的高低壓差
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還有dounce下去作物理性破壞才可以lysis完全
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BTW NP40的上限是1％ and我很確定CERII是NP40
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一般高鹽抽出核蛋白的方式都是在已經打破核膜的情況下
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在高鹽的情況下,DNA會沉澱,蛋白質會溶在上清液,藉此分離
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所以有沒有另一種可能,就是加CERII(NP40)後,核膜破掉了
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但lamin還維持核的結構(membrane包覆著lamin)
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最後離心後藉高鹽將DNA及proteins分開.
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推
05/28 09:25, , 53F
要不要乾脆我附DATA算了?一翻兩瞪眼?
05/28 09:25, 53F
推
05/28 12:25, , 54F
樓上呀..你已經給他魚竿了..他想吃魚就得自己釣囉 @w@a
05/28 12:25, 54F
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05/28 22:33, , 55F
不過討論嘛,不需要這麼激動,感謝
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05/28 22:55, , 56F
我說的另一種可能,就是你講的那樣,CERII是NP40,NER是高鹽溶液
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05/28 22:56, , 57F
我純粹對原理感興趣罷了....
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順帶一提,發表在Science signaling的一篇
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DOI: 10.1126/scisignal.2002373,裡面提到這個kit
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NE-PER,在核的部份其實會雜到membane protein的markers
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05/28 23:05, , 61F
上面沒有講清楚,是plasma membrane proteins
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05/29 01:54, , 62F
其實市面上的kit多少都還是會分不乾淨的......
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05/29 01:54, , 63F
T大其實已經說的很清楚~連原理都附給你了~真的= =
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05/29 08:45, , 64F
我從頭到尾都很感謝有人願意回答這個問題 謝謝
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05/29 09:00, , 65F
這個討論串其實讓我學到不少
05/29 09:00, 65F
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